產(chǎn)黃青霉苯乙酰CoA連接酶的研究和定點(diǎn)突變.pdf

1、青霉素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，因其療效好，抗菌活性強(qiáng)，對(duì)人體細(xì)胞毒性小且價(jià)格低廉而廣泛應(yīng)用，是目前治療感染性疾病的重要藥物。
　　 產(chǎn)黃青霉是一種絲狀真菌，是青霉素的生產(chǎn)用菌，以α-氨基己二酸、半胱氨酸和纈氨酸為原料的青霉素生物合成途徑已有詳細(xì)的闡述，通過菌種改良以獲得更高產(chǎn)量是工業(yè)生產(chǎn)的重要課題。
　　 苯乙酰CoA連接酶(PCL)在青霉素合成途徑中，催化苯乙酸與CoA反應(yīng)生成苯乙酰CoA，苯乙酰CoA再在異青霉素N酰

2、基轉(zhuǎn)移酶(IAT)的催化下，與6-APA反應(yīng)生成青霉素G。敲除了產(chǎn)黃青霉中編碼PCL的基因(phl)，青霉素的合成量明顯減少，因此，苯乙酰CoA連接酶是青霉素G生物合成途徑中，增加苯乙酸側(cè)鏈前體物質(zhì)利用效率的重要酶之一。因此，克隆產(chǎn)黃青霉的苯乙酰CoA連接酶基因，并進(jìn)行異源表達(dá)，可以為研究該酶的催化作用機(jī)制、酶的性質(zhì)、對(duì)青霉素合成的影響以及代謝工程改造青霉素生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法，從產(chǎn)黃青霉中克隆了

3、苯乙酰CoA連接酶(phl)基因，構(gòu)建了pET30a-phl表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化了蛋白，研究了PCL的基本性質(zhì)。
　　 本研究主要研究成果如下：
　　 1、本文克隆了產(chǎn)黃青霉中phl基因，構(gòu)建了pET30a-phl表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21(DE3)中異源表達(dá)。在16℃低溫誘導(dǎo)下，SDS凝膠電泳出現(xiàn)一條分子量約為60 kDa的明顯條帶，與報(bào)道的苯乙酰C

4、oA連接酶酶蛋白的理論分子量62.1 kDa一致。重組質(zhì)粒pET30a-phl在BL21(DE3)中表達(dá)的酶活達(dá)到1680 U/mL。
　　 2、本文克隆的產(chǎn)黃青霉中phl基因所編碼的苯乙酰CoA連接酶，通過序列分析以及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，其氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中多個(gè)產(chǎn)黃青霉的苯乙酰CoA連接酶(登錄號(hào)分別為：XM_002565364.1，AJ001540.1，NW_003020081.1，AM920437.1，.AM048877.

5、1)100％同源，與Aspergillus fumigatus Af293(XP_753893.2)、Neosartoryafischeri NRRL181(XP_001259941.1)、Aspergiilus oryzae RIB40(XP_001823173.1)Aspergillus flavus NRRL3357(XP_002378509.1)、Aspergillus clavatus NRRL1(XP_001274067.1

6、)、Aspergillus terreus NIH12624(XP_001216727.1)達(dá)到70％以上同源。
　　 3、純化酶PCL的基本性質(zhì)：最適溫度是30℃；有一定的熱穩(wěn)定性；最適pH為8.0；pH7.0-8.5酶比較穩(wěn)定。
　　 4、采用重疊延伸PCR法(Over-lap extension PCR，OE-PCR)，實(shí)現(xiàn)PCL定點(diǎn)突變，獲得G337S突變子、G337D突變子、G337K突變子、G337F突變子、