花生白藜蘆醇合成酶及4-香豆酰CoA連接酶基因的克隆與表達.pdf

1、白藜蘆醇(Resveratrol,Res)是一種植物抗毒素(phytoalexin),屬非黃酮類多酚化合物。Res不但能提高植物對紫外線、真菌等傷害的抵御能力,而且而且具有抗氧化、抗腫瘤、抗血小板凝聚、保護心血管、調(diào)節(jié)雌激素等多種功效。因此,提高植物中Res的含量已成為研究的熱點。Res廣泛存在于種子植物中,但含量很低,要獲得高純度Res比較困難且成本較高。因此,利用基因工程的方法是提高植物中Res含量的可行途徑之一。 本研究從

2、花生H2007基因組中擴增出約500bp的白藜蘆醇合成酶基因(RS)的保守序列,根據(jù)獲得序列設(shè)計巢式基因特異性引物,以花生cDNA作為模板,通過3’-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends),獲得15個不同RS基因的片段,序列分析結(jié)果表明,15個RS基因的3’-UTR堿基長度不等,最短的有69bp,最長的有244bp,兩兩比較相似性為23％-100％。四組RS基因的部分編碼區(qū)聚類分析結(jié)果與3’-UTR

3、區(qū)相同。再通過TAIL-PCR步移出RS基因的5’端,然后以花生的cDNA作為模板擴增出約1200bp RS基因條帶,經(jīng)測序后分析發(fā)現(xiàn),該序列大小為1170bp,與已發(fā)表的來源于花生的RS的核酸序列相似性為91％,并且是一個完整的開放閱讀框。將其克隆到大腸表達載體pET-32a上,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,獲得工程菌DE3(pET-32a-RS),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,用SDS-PAGE檢測45KDa重組蛋白,與報道相同。在花生中,

4、RS所需要的底物4-香豆酰輔酶A含量較少,可能會影響到RS的表達量,而4-香豆酰輔酶A連接酶(4-CL)能將4-香豆酸催化成4-香豆酰輔酶A,因此,本實驗為了提高RS在植物中的表達量,以毛白楊木質(zhì)化莖的cDNA為模板擴增出4-CL基因,大小為1611bp,該序列與已發(fā)表的4CL的核酸序列相似性為99％,是一個完整的開放閱讀框。將其克隆到大腸表達載體pET-32a上,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,獲得工程菌DE3(pET-32a-4C