dna連接酶

1、基因工程的基本內(nèi)容,Gene engineering,基因決定性狀（一）,青霉菌能產(chǎn)生對人類有用的抗生素——青霉素,基因決定性狀（二）,家蠶能夠吐出蠶絲為人類利用,基因決定性狀（三）,豆科植物的根瘤能夠固定空氣中的氮,定向基因改造設(shè)想,設(shè)想一,能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？,能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？,設(shè)想二,能否讓微生物產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？,設(shè)想三,經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造

2、生物的新技術(shù)——基因工程。,基因?qū)π誀畹目刂?1.通過控制蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)來影響性狀,定向改造生物的依據(jù),基因工程概念,基因工程：在生物體外，通過對DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出所需要的基因產(chǎn)物。,基因操作的工具,基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶,基因工程過程示意圖,基因的針線——DNA連接酶,基因的運(yùn)輸工具——運(yùn)載體,基因工程過程示意圖,

3、①從細(xì)胞中分離出DNA,,,②限制酶截取DNA片斷,③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒,④ DNA重組,⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因,返 回,限制性內(nèi)切酶,分布：主要在微生物中。特點(diǎn)：特異性，即識別特定核苷酸序列， 切割特定切點(diǎn)。結(jié)果：產(chǎn)生黏性未端（堿基互補(bǔ)配對）。舉例：大腸桿菌的一種限制酶能識別 GAATTC序列，并在G和A之間切開。,返 回,DNA連接酶,連接酶的作用：將互補(bǔ)配對的兩個(gè)黏

4、性末端連接起來，使之成為一個(gè)完整的DNA分子。連接的部位：磷酸二酯鍵，不是氫鍵。DNA連接酶的作用過程,返 回,運(yùn)載體,作用：將外源基因送入受體細(xì)胞。條件：能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定地保存。具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)。具有某些標(biāo)記基因種類：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。質(zhì)粒的特點(diǎn),能將外源基因送入受體細(xì)胞的工具就是運(yùn)載體。,返 回,基因操作的基本步驟,提取目的基因,目的基因與運(yùn)載體結(jié)合,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,目的基因的檢測和表達(dá)

5、一,目的基因的檢測和表達(dá)二,提取目的基因,將需要的基因從供體生物的細(xì)胞內(nèi)提取出來。,,,取 出DNA,用限制酶切斷DNA,目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。,返 回,提取目的基因的方法（一）,直接分離基因——鳥槍法,將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段，再用運(yùn)載體將這些片段都運(yùn)載到受體生物的不同細(xì)胞中去。只要有一個(gè)細(xì)胞獲得了需要的目的基因并得以表達(dá)，

6、基因工程就算成功了?！　≡摲ㄗ畲蟮娜秉c(diǎn)是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。,,,用限制酶切成許多片斷,下一頁,,提取目的基因的方法（二）,人工基因合成法,反轉(zhuǎn)錄法：直接合成法： 用游離的脫氧核苷酸 直接合成相應(yīng)的基因。,DNA合成儀,PCR擴(kuò)增儀,返 回,目的基因與運(yùn)載體結(jié)合,返 回,,目的基因,重組DNA（質(zhì)粒）,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并擴(kuò)增,,,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

7、,將受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,返 回,基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。,目的基因的檢測和表達(dá)（一）,為保證目的基因得到有效利用，通常用大量的受體細(xì)胞來接受不多的目的基因。,細(xì)菌的檢測：將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。,返 回,目的基因的檢測和表達(dá)（二）,返 回,多細(xì)胞生物的檢測：將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個(gè)體，檢測這些個(gè)體是否攝入目的基因，攝入的基因是

8、否表達(dá)（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。,,（轉(zhuǎn)基因生物）,,提取目的基因,目的基因與運(yùn)載體結(jié)合,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,目的基因的檢測和表達(dá),小 結(jié),練習(xí),1988年5月中國青年科學(xué)家陳炬成功地把人的干擾素基因移植到煙草的DNA分子上，轉(zhuǎn)化后的煙草具備了抗病毒能力。,1.人的基因之所以能接到植物細(xì)胞中，物質(zhì)基礎(chǔ)是 。2.煙草能抗病毒是因?yàn)轶w內(nèi)產(chǎn)生了 。3.以上事實(shí)可說明哪些問題？,練習(xí),返回,二、基因工程的成果與

9、發(fā)展前景,1.醫(yī)藥衛(wèi)生方面，基因工程有哪些應(yīng)用和前景？,2.農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)方面，基因工程有哪些應(yīng)用 和前景？,3.環(huán)境保護(hù)方面，基因工程有哪些應(yīng)用和前景？,4.你想像中未來的基因工程會(huì)有怎樣的發(fā)展？,1.基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生,Ａ、生產(chǎn)基因工程藥品,工程菌：用基因工程方法，使外源基因得到高效表達(dá)的菌類細(xì)胞株系。,Ｂ、基因診斷,back,DNA探針：利用DNA分子雜交原理,外源正?；?qū)氚屑?xì)胞,與基因治療,back,2.基因工程與農(nóng)牧

10、業(yè)、食品工業(yè),A、在農(nóng)業(yè)方面，可獲得高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和具優(yōu)良品質(zhì)的農(nóng)作物；培育出具各種抗性的作物新品種。,B、在畜牧業(yè)上，可獲得人們需要的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,顯微注射技術(shù)：,C、為人類開辟新的食物來源,3.基因工程與環(huán)境保護(hù),back,檢測病毒：用DNA探針（由特定DNA片段制成）,凈化環(huán)境：創(chuàng)造出“超級細(xì)菌”；吞噬汞和降解土壤中DDT的細(xì)菌；凈化鎘污染的植物；構(gòu)建新的殺蟲劑。,袁隆平的夢想,我做過這樣一個(gè)夢：有一天傍晚，我和我的助手走過我們的試驗(yàn)田

11、，發(fā)現(xiàn)水稻長得象高粱那么高，穗子有掃帚那么長，籽粒有花生那么大……理論上，光能利用率可以達(dá)到5%，而現(xiàn)在只有1% ……,讓農(nóng)作物成為“靈丹妙藥”轉(zhuǎn)基因西紅柿與SARS抗體基因治療面面觀餐桌上的轉(zhuǎn)基因食品2050年——基因工程和我的生活,基因工程——潛在的危險(xiǎn),back,1990年美國國立衛(wèi)生研究院治愈一位“重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合癥”的4歲女孩,基因治療：用一個(gè)正常的基因來代替缺陷基因,ADA基因缺陷ADA：腺苷酸脫氨酶,bac

12、k,基因結(jié)構(gòu)的基本單位相同密碼子相同蛋白質(zhì)合成方式相同,基因治療（gene therapy）是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的。也就是將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。基因治療主要以兩種策略達(dá)到治療目的。其一是正?；騺砑m正突變基因，也就是在原位修復(fù)缺陷基因的直接療法，此乃理想的基因治療策略，由于多種困難，目前尚未實(shí)現(xiàn)；其

13、二是用正常基因不替代致病基因的間接療法，此法較前者難度小，也是目前眾多主張采用的策略，并已付諸臨床實(shí)踐。而就基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞不同，基因治療又有兩種途徑,即生殖（種系）細(xì)胞基因治療和體細(xì)胞基因治療。,back,日本科學(xué)家近日發(fā)現(xiàn)，寄生在昆蟲體內(nèi)的細(xì)菌基因可進(jìn)入寄主昆蟲的細(xì)胞核，并通過寄主昆蟲把細(xì)菌基因遺傳下去。這一發(fā)現(xiàn)有可能使人們重新認(rèn)識生物進(jìn)化論學(xué)說，高度警惕轉(zhuǎn)基因技術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)。包括人類在內(nèi)，各種生物的染色體內(nèi)都有可能汲取了寄生或共生在

14、生物體內(nèi)的微生物的基因。不同種類生物之間轉(zhuǎn)基因現(xiàn)象范圍不斷擴(kuò)大的事實(shí)，對了解生物進(jìn)化的原因和病原體相互作用原理將大有幫助。同時(shí)也向人類發(fā)出警告：轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)入基因有可能擴(kuò)散到其它生物。,生物安全的特點(diǎn)：轉(zhuǎn)基因生物體對人類和環(huán)境的影響是長期的，不可預(yù)見的，很多影響可能產(chǎn)生滯時(shí)效應(yīng)，不像非生物影響那樣隨時(shí)間而減小，隨距離而減弱，大量的轉(zhuǎn)基因生物是以特殊的生命形式，以超過自然進(jìn)化千百倍的速度介入到自然界來，潛在的危險(xiǎn)可能會(huì)更大。,b

15、ack,DNA連接酶的作用原理,主 頁,一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割點(diǎn)上將DNA 分子切斷。目前已發(fā)現(xiàn)的限制酶有200多種。,返 回,DNA連接酶的作用過程,返 回,質(zhì) 粒,返 回,質(zhì)粒的特點(diǎn),細(xì)胞染色體外能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子；質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體；最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒；存在于許多細(xì)菌及酵母菌等生物中；質(zhì)粒的存在對宿主細(xì)胞無影響；質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成

16、。,返 回,小 結(jié),基因工程的基本內(nèi)容,,基因操作的基本步驟,,基因操作的工具,,限制性內(nèi)切酶,DNA連接酶,運(yùn)載體,概念辨析,遺傳信息—密碼子—遺傳性狀,限制性內(nèi)切酶—DNA連接酶—DNA聚合酶,目的基因—供體細(xì)胞—受體細(xì)胞—轉(zhuǎn)化細(xì)胞,復(fù)制—轉(zhuǎn)錄—翻譯,根據(jù)蛋白質(zhì)合成中遺傳信息傳遞的過程填表：,A,遺傳信息在？DNA-a DNA-bmRNA tRNA,,,亮氨酸,HIV,next,back,如果想要

17、獲得一定的基因，可以有哪些途徑？,常用的是“鳥槍法”——直接剪切供體細(xì)胞DNA分子,1、以信使RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄并互補(bǔ)成DNA分子,2、根據(jù)已知的氨基酸序列推測出基因的核苷酸序列，直接合成DNA分子,直接分離基因——,人工合成基因——,,基因操作的工具,聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)的基本原理　類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶

18、序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNT

19、P為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：　　　10×擴(kuò)增緩沖液 　 10ul　　　4種dNTP混合物 　 各200umol/L　　　引物 　　　　 　 各10～

20、100pmol　　　　模板DNA 　　　 　0.1～2ug　　 　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　加雙或三蒸水至 　100ul　　PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+　　引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互