泛素連接酶Hrd1介導(dǎo)的tau蛋白降解.pdf

1、神經(jīng)細胞中的tau蛋白異常聚集是許多神經(jīng)退行性疾病共有的病理特征，例如在阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，進行性核上癱(progressivesupranuclear palsy)及第17號染色體異常導(dǎo)致的額顳葉型癡呆伴巴金森癥(frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17，F(xiàn)TDP-17)，這些疾病統(tǒng)稱為tau蛋白病(ta

2、uopathy)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，人類的泛素連接酶Hrd1和tau在AD病人的皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元內(nèi)有共定位。且Hrd1的表達和異常磷酸化tau的聚集存在負(fù)相關(guān)。我們在細胞模型上觀察到Hrd1的表達可以減少tau的毒性，并發(fā)現(xiàn)該作用與Hrd1能降低tau蛋白總體水平有關(guān)。在上述研究的基礎(chǔ)上，本文進一步探討了Hrd1減少細胞內(nèi)tau蛋白水平的相關(guān)機制。這不僅有助于進一步認(rèn)識Hrd1的功能和tau蛋白病的病理機制，也為以Hrd1為靶點的藥物

3、設(shè)計和篩選提供技術(shù)平臺。 目的：觀察Hrd1能減少細胞內(nèi)tau蛋白水平是否與其介導(dǎo)tau降解有關(guān)及其降解機制。 方法：將pEGFP-C1-tau真核細胞表達質(zhì)粒與野生型。Hrd1或酶失活型Hrd1C1A轉(zhuǎn)染293T細胞，然后用Western blot方法檢測細胞內(nèi)相關(guān)蛋白的水平；同時用GSK-3 β誘導(dǎo)tau過度磷酸化，觀察Hrd1過度磷酸化的tau降解的影響。用CHX示蹤法觀察蛋白質(zhì)的降解；用免疫熒光雙標(biāo)及免疫沉淀法觀

4、察Hrd1和tau的相互作用。 結(jié)果： 1.Hrd1降低細胞內(nèi)磷酸化及非磷酸化tau的水平采用非神經(jīng)來源的293T細胞株，轉(zhuǎn)染GFP-tau、wtHrd1和Hrd1C1A質(zhì)粒，并用GSK-3 β共轉(zhuǎn)染細胞以誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后16-24 h，共轉(zhuǎn)染Hrd1的細胞熒光減弱。Western blot結(jié)果顯示：與單獨轉(zhuǎn)染tau質(zhì)粒的細胞相比，共轉(zhuǎn)染Hrd1的細胞內(nèi)磷酸化及非磷酸化tau的水平都明顯減少，而共轉(zhuǎn)

5、染Hrd1C1A則對細胞內(nèi)tau的水平?jīng)]有明顯影響。提示，Hrd1能降低細胞內(nèi)磷酸化及非磷酸化tau的總體水平，這可能是Hrd1減少tau毒性的病因。 2.Hrd1促進tau蛋白的降解為了進一步觀察tau蛋白的減少是否由于tau降解增加所致，我們在轉(zhuǎn)染后24 h，在細胞的培養(yǎng)上清液中加入放線菌酮(CHX)以阻斷tau的蛋白合成，并于加入CHX后4 h，8 h，16 h分別收取細胞，用免疫印記分析tau的水平。結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染Hrd

6、1的細胞，tau蛋白的清除加快。表明Hrd1可以促進tau的降解。 3.Hrd1促進磷酸化tau蛋白的降解年齡相關(guān)的NFTs的形成具有神經(jīng)毒性，高度磷酸化的tau在這個過程中具有重要作用。以前的研究表明泛素連接酶CHIP可以識別磷酸化的tau蛋白，并且在tau蛋白上加上泛素。我們在293T細胞中共轉(zhuǎn)染編碼tau和GSK-3 β的質(zhì)粒來誘導(dǎo)tau的磷酸化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSK-3 β磷酸化后tau蛋白的總體水平提高。這個可能由于tau磷

7、酸化后穩(wěn)定性提高的緣故。當(dāng)共轉(zhuǎn)染Hrd1時，Hrd1降低了GSK-3 β誘導(dǎo)的磷酸化tau的總量。CHX實驗表明wtHrd1可以促進磷酸化tau蛋白的降解。這些結(jié)果表明Hrd1可以促進磷酸化tau蛋白的降解。 4.蛋白酶體參與Hrd1介導(dǎo)的tau降解有報道顯示，蛋白酶體可以降解tau蛋白。為了觀察蛋白酶體是否參與了Hrd1介導(dǎo)的tau蛋白降解，我們在293T細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染tau或共轉(zhuǎn)染tau和Hrd1，在收取細胞前4 h，培養(yǎng)液內(nèi)加

8、入蛋白酶體抑制劑MGl32或溶酶體抑制劑氯化銨。結(jié)果表明，蛋白酶體抑制劑MG132可以穩(wěn)定tau蛋白的表達，而氯化銨不能穩(wěn)定tau的表達。當(dāng)用N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)抑制去泛素化后，我們可以觀察到高分子量tau的聚集，這些結(jié)果表明蛋白酶體參與了Hrd1介導(dǎo)的tau蛋白的降解。 5.Hrd1與tau蛋白的相互作用我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，Hrd1可加強胞質(zhì)蛋白帶有擴展型多聚谷氨酰胺Huntingtin的降解。Hrd1是否也可以與

9、胞質(zhì)蛋白tau相互作用呢?為了回答這個問題，我們首先進行了免疫共沉淀(IP)實驗。在293T細胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染tau和Hrd1的質(zhì)粒，24h后收集細胞并裂解，然后用單克隆抗體tau-5進行免疫沉淀細胞裂解液中的tau蛋白，再用免疫印跡(IB)法檢測Hrd1是否可以被tau共沉淀下來。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在IP tau時，同時把Hrd1共沉淀下來，而且這種作用是不依賴于Hrd1的E3活性的。同時，我們使用免疫熒光雙標(biāo)時發(fā)現(xiàn)，Hrd1與tau在細胞內(nèi)有共定

10、位。提示Hrd1與tau蛋白存在相互作用。 6.Hrd1增強tau的泛素化為了更進一步確定Hrd1可以泛素化tau蛋白，我們在293T細胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染編碼Hrd1，His-tau，ubiquitin蛋白的質(zhì)粒。蛋白酶體抑制劑MG132用來抑制泛素化tau的降解。我們發(fā)現(xiàn)Hrd1的過表達可以增加高分子量的tau，當(dāng)用GFP-tau質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞時，也得到了同樣的結(jié)果。在免疫沉淀實驗中，抑制蛋白酶體活性后，轉(zhuǎn)染Hrd1質(zhì)粒的細胞tau的泛

11、素化明顯增強。這些高分子量tau的形成與tau的泛素化有關(guān)。為了了解tau磷酸化對Hrd1介導(dǎo)的tau泛素化的影響，我們在293T細胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染編碼GSK-3 β的質(zhì)粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在共轉(zhuǎn)染GSK-3 β的細胞內(nèi)，高分子量tau蛋白的量顯著增加，提示GSK-3 β誘導(dǎo)的磷酸化可以穩(wěn)定泛素化的tau蛋白。結(jié)論： 以上研究結(jié)果表明，Hrd1可以促進細胞內(nèi)過度表達的磷酸化和非磷酸化tau的降解，這種作用依賴其E3活性；泛素-蛋白酶體通路參