泛素連接酶MAFbx介導(dǎo)的AMPK激活對心肌肥大的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、心肌肥大是心肌細(xì)胞對機(jī)械張力以及各種刺激的重塑反應(yīng)，而持續(xù)的肥大顯著增加心力衰竭、惡性心律失常和心源性猝死的風(fēng)險。在細(xì)胞水平，細(xì)胞大小取決于蛋白質(zhì)合成與分解的動態(tài)過程。由于促肥大信號通路過多而且肥大信號之間關(guān)系錯綜復(fù)雜，使得抑制促肥大信號往往對心肌肥大抑制效果欠理想。而激活細(xì)胞內(nèi)萎縮信號通路增加蛋白質(zhì)降解可能成為逆轉(zhuǎn)心肌肥大的新靶點。近年來的研究表明單磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)對心肌肥大具有抑制作用，但機(jī)制尚未明確。我們通過苯腎

2、上腺素(PE)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大，觀察AMPK激活對萎縮信號通路FOXO3a/MAFbx和細(xì)胞蛋白降解的影響，以闡明FOXO3a/MAFbx在AMPK激活逆轉(zhuǎn)心肌肥大中的作用。本研究分為四個部分：
　　 第一部分：AMPK激活對心肌肥大的抑制作用。
　　 目的：探討AMPK激活對PE誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響。
　　 方法：培養(yǎng)出生1-3天SD大鼠心肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞分離后培養(yǎng)48 h，繼以無血清

3、培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用不同濃度5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核昔酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide-4-ribofuranoside,AICAR)干預(yù)，分為5個劑量組(0，0.25 mM，0.5 mM，1.0 mM，2.0 mM)刺激心肌細(xì)胞，用Western blot方法測定心肌細(xì)胞AMPK，p-AMPK水平，確定AICAR對AMPK的激活作用。再以10μM的PE刺激心肌細(xì)胞構(gòu)建心肌肥大模型，給予AMPK激

4、動劑AICAR和AMPK的抑制劑Compound C(1μM)預(yù)處理，并用計算機(jī)輔助軟件測量細(xì)胞表面積以及Real-time PCR檢測ANP、BNP mRNA水平以觀察AMPK對心肌肥大的影響。分組如下(每組實驗均為5孔，即n=5)：空白對照組，AICAR組(1.0mM)，PE組(10μM)，AICAR+PE組，AICAR+PE+CompondC(1μM)。
　　 結(jié)果：⑴在基礎(chǔ)狀態(tài)下，培養(yǎng)的心肌細(xì)胞p-AMPK在較低水平。與

5、對照組比較，0.25mM，0.5 mM，1.0 mM，2.0 mM4個劑量組AICAR干預(yù)后均增加p-AMPK水平(分別為：P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，而對總AMPK表達(dá)水平無影響。⑵與對照組比較，PE組心肌細(xì)胞表面積明顯增大(P＜0.01)，ANP、BNP的mRNA表達(dá)增加(分別為P＜0.01)。與PE比較，AICAR顯著抑制PE誘導(dǎo)的細(xì)胞表面積增大以及ANP、BNP mRNA表達(dá)增加(分別為P＜0.01

6、)；而Compond C則逆轉(zhuǎn)了AICAR該作用(分別為：P＜0.01)。
　　 結(jié)論：①AICAR能夠激活心肌細(xì)胞AMPK活性。②AMPK激活能夠顯著抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。
　　 第二部分：MAFbx在AMPK抑制心肌肥大中的作用。
　　 目的：探討泛素連接酶MAFbx是否參與AMPK調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大作用。
　　 方法：心肌細(xì)胞培養(yǎng)，實驗分組以及藥物干預(yù)同第一部分。Real-time PCR和We

7、stern blot檢測AMPK激活對MAFbx mRNA以及蛋白表達(dá)的影響，高效液相色譜儀檢測蛋白降解率。
　　 結(jié)果：與對照組比較，AICAR組MAFbx mRNA以及蛋白表達(dá)上調(diào)(分別為：P＜0.01，P＜0.05)；PE組MAFbx mRNA以及蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(分別為P＜0.05，P＜0.01)。與PE比較，AICAR逆轉(zhuǎn)了PE對MAFbx mRNA以及蛋白表達(dá)的抑制作用(分別為P＜0.05，P＜0.01)；而Comp

8、ond C則阻斷了AICAR該作用(分別為P＜0.05，P＜0.01)。⑵與對照組比較，PE抑制心肌細(xì)胞蛋白降解(P＜0.01)；AICAR明顯促進(jìn)蛋白降解并逆轉(zhuǎn)了PE對蛋白降解的抑制作用(P＜0.01)；而Compond C則阻斷了AICAR該作用(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：MAFbx參與AMPK對心肌細(xì)胞蛋白降解以及心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用。
　　 第三部分：MAFbX-siRNA對AMPK抑制心肌肥大作用的影響<

9、br>　　 目的：進(jìn)一步證實MAFbx參與了AMPK抑制心肌細(xì)胞肥大作用。
　　 方法：細(xì)胞分離培養(yǎng)同第一部分，細(xì)胞分為4組：空白對照組，siRNA陰性對照組，MAFbx-siRNA組，AICAR+MAFbx-siRNA組。Western blot檢測MAFbx-siRNA對MAFbx蛋白表達(dá)的影響以了解小干擾的抑制效果。再將細(xì)胞分為7組：空白對照組，AICAR組，PE組，AICAR+PE組，siRNA陰性對照組，MAFbx

10、siRNA組，AICAR+PE+MAFbx-siRNA組。測量心肌細(xì)胞表面積和蛋白降解率，觀察siRNA沉默MAFbx后AMPK對心肌細(xì)胞肥大的影響。
　　 結(jié)果：⑴與對照組比較，MAFbx-siRNA有效沉默MAFbx表達(dá)(P＜0.01)。⑵與對照組比較，MAFbx被抑制后細(xì)胞表面積明顯增大(P＜0.01)；與AMPK+PE組比較，MAFbx被沉默后AMPK抑制心肌細(xì)胞肥大作用受阻(P＜0.01)。⑶與對照組比較，MAFbx沉

11、默后細(xì)胞蛋白降解明顯減少(P＜0.01)；與AMPK+PE組比較，MAFbx被沉默后蛋白降解受抑制(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：AMPK通過調(diào)控MAFbx信號通路促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白降解以及抑制心肌肥大。
　　 第四部分：AMPK調(diào)控MAFbx的機(jī)制。
　　 目的：探討AMPK在抑制心肌細(xì)胞肥大的作用中激活MAFbx的機(jī)制。
　　 方法：心肌細(xì)胞培養(yǎng)，實驗分組以及藥物干預(yù)同第一部分。用Western blo

12、t方法測定心肌細(xì)胞FOXO3a，p-FOXO3a水平，確定AICAR對轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a的激活作用。
　　 結(jié)果：與對照組比較，AICAR組p-FOXO3a表達(dá)水平降低(P＜0.05)，PE則顯著上調(diào)p-FOXO3a表達(dá)(P＜0.01)。與PE組比較，AICAR顯著逆轉(zhuǎn)了PE誘導(dǎo)的p-FOXO3a上調(diào)(P＜0.01)，而Compond C則抑制了AICAR該作用(P＜0.01)。各組總FOXO3a蛋白表達(dá)無顯著性差異(P＞0.