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文檔簡介
1、自噬是溶酶體降解途徑,在許多生物學過程中起重要作用,例如,饑餓、感染、肌肉萎縮、癌癥、心血管疾病和宿主防御等,在心臟中自噬過程失調能引起心肌功能障礙和心衰。自噬和泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是細胞內蛋白降解的兩個主要通路,最新研究表明在心臟中這兩個蛋白降解系統(tǒng)之間存在和協(xié)同和互補的關系。Atrogin-1/MAFbx是肌肉特異表達的泛素E3連接酶,由355個氨基酸組成,含有一個功能性的F-box結構域,它與Skp1,Cul1和Roc1結合
2、形成具有泛素連接酶活性的SCF復合物。研究表明E3連接酶atrogin-1/MAFbx在肌肉萎縮、心肌肥大和心肌細胞凋亡中起著重要的作用。但是atrogin-1/MAFbx在心肌細胞自噬中的作用未見報道。
自噬在固有免疫中起著重要的作用。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)與細胞上的受體Toll樣受體4(TLR4)結合,促進β-catenin在細胞質積累并轉位至細胞核內,引起靶基因轉錄和表達,導致心肌肥大
3、。但是LPS在心肌細胞中是否通過促進β-catenin激活和核轉位,激活自噬相關基因表達還不清楚。
研究方法:首先原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠心肌細胞用Ad-GFP或Ad-atrogin-1-GFP或Ad-β-catenin-GFP分別感染24h以及Ad-atrogin-1-GFP和Ad-β-catenin-GFP共感染24h后,用LPS(100ng/ml)刺激8h,4%甲醛固定15min,用抗LC3或α-actinin抗體行免疫標
4、記并用Alexa Fluor568連接的羊抗兔或抗鼠IgO進行免疫熒光染色,用DAPI進行核染色。通過數(shù)LC3陽性點和標準化橫切面積對自噬小體進行定量,用image-pro plus6.0軟件定量含自噬小體細胞的百分率以及細胞平均面積;Trizol法抽提總RNA,用大鼠特異引物LC3,Atg12,Atg4b,Bnip1,Bnip3和vp34進行實時定量RT-PCR分析,實驗重復三次;用40μg的細胞總蛋白和抗LC3抗體或抗β-caten
5、in抗體進行Western blotting檢測。用體外GST pull-down和免疫共沉淀實驗分別證明atrogin-1/MAFbx與β-catenin相互作用。
研究結果:(1)LPS誘導原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠心肌細胞肥大和自噬小體形成。(2)Atrogin-1過表達可抑制LPS誘導的心肌肥大、自噬小體形成和自噬相關基因如LC3,Atg12,Atg4b,Bnip1,和vp34表達。Western blotting結果表明
6、atrogin-1也可抑制LPS誘導LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉換。(3)過表達的β-catenin可促進LPS誘導的心肌細胞肥大、自噬小體形成及許多自噬相關基因包括LC3、Atg12、Atg4b、Vps34(aclassⅢ PI3K)和Bnip1的表達。Western blotting表明過表達β-catenin也可促進LPS誘導的LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉換。(4)過表達atrogin-1可明顯抑制LPS誘導β-catenin介導的心
7、肌肥大、自噬小體形成、自噬相關基因的表達及LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉換。(5)Western blotting表明過表達atrogin-1可降低內源性β-catenin蛋白水平且呈劑量依賴關系。(6)GST pull-down和免疫共沉淀實驗證明atrogin—1與β-catenin直接相互作用,主要通過atrogin-1的60-160氨基酸。
結論:本研究明確atrogin-1直接與β-catenin相互作用,下調內源性
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