CaN Aβ mRNA基因沉默對醛固酮誘導的心肌細胞肥大的抑制作用.pdf

1、背景與目的：心肌肥大是多種心血管疾病的共同病理過程，是導致心原性死亡的最重要的病理基礎之一。近年來，神經體液因素尤其是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)失調所造成的心肌肥大越來越受到重視?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，醛固酮是心肌肥大的重要誘導因素。研究表明，CaN依賴的信號通路可能在心肌肥大的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前在心肌肥大的發(fā)生機制的研究上，有人應用RNAi技術在培養(yǎng)的心肌細胞上研究有關肥大的相關基因，但目前尚無直接針對CaN進行RNAi的研

2、究。我們認為針對CaN致心肌肥大的瓶頸作用，通過RNAi技術，進行深入研究具有重要意義。本課題在培養(yǎng)的原代大鼠心肌細胞上，在醛固酮等引起心肌細胞肥大的刺激因素作用下，同時應用CaN的特異性抑制劑-環(huán)孢霉素A(cyclosporinA,CsA)及醛固酮受體拮抗劑螺內酯，通過測定細胞大小、肥大相關基因ANF及β-MHC表達、CaN基因表達及蛋白表達水平，進一步觀察CaN在醛固酮刺激引起的心肌細胞肥大中的重要作用。應用siRNA特異性引起Ca

3、NAβmRNA的基因表達沉默，通過測定CaNmRNA及其蛋白表達水平觀察所選擇的siRNA片段所引起的RNAi的效果，從而更能明確CaNAβmRNA的功能片段所在位置。 方法：取1-3d齡Wistar乳鼠心肌細胞進行培養(yǎng)。實驗分組：醛固酮組：每孔加入醛固酮10-9mol/L；空白對照組：不加任何處理因素，與加入處理因素的組別共同進行換液處理；靶標siRNA組：每孔除加入醛固酮10-9mol/L外，另外予以細胞2μl/孔針對CaN

4、AβmRNA的能在細胞內表達siRNA的DNA表達盒進行轉染；靶標siRNA陰性對照組每孔除加入醛固酮10-9mol/L外，另外加入2μl/孔能在細胞內表達siRNA陰性對照的DNA表達盒進行轉染；CsA組：每孔除加入醛固酮10-9mol/L外，另外加入CsA5×10-3mol/l；螺內酯組：每孔除加入醛固酮10-9mol/L外，另外加入螺內酯3×10-6mol/L。測定各組心肌細胞表面積，心肌細胞中肥大相關基因心房利鈉因子(ANF)及

5、β重鏈肌球蛋白(β-MHC)及CaNAβmRNA的水平，同時用免疫組化及免疫熒光方法觀察心肌細胞中CaNAβ及α-actin的表達。 結果：醛固酮可使心肌細胞表面積增加，使心肌細胞肥大相關基因ANF、β-MHC的mRNA表達水平明顯升高，心肌細胞中CaNAβmRNA表達明顯升高；心肌胞漿中CaNAβ及α-actin蛋白表達上調；CsA及螺內酯干預后，可明顯抑制心肌細胞表面積的增大，并下調心肌肥大相關基因ANF及β-MHCmRNA

6、表達水平，心肌胞漿中CaNAβ及α-actin表達亦降低。應用siRNA干預后靶標siRNA組大鼠心肌細胞表面積的增大受到抑制，心肌細胞中CaNAβmRNA表達受到明顯抑制，同時心肌肥大相關基因ANF及β-MHCmRNA表達水平未上調，心肌細胞胞漿中CaNAβ及α-actin表達較醛固酮組降低。而靶標siRNA陰性對照組大鼠心肌細胞各項指標變化均同醛固酮組相似，未受到抑制，心肌細胞表面積增加，心肌肥大相關基因ANF、β-MHCmRNA表

7、達水平明顯升高，心肌細胞中CaNAβmRNA表達明顯升高；心肌胞漿中CaNAβ及α-actin蛋白表達上調。 結論：在細胞分子水平上進一步證明醛固酮是大鼠心肌細胞肥大的重要誘導因素；CaN信號分子參與了醛固酮誘導的心肌細胞肥大；應用siRNA干擾CaNAβmRNA的表達，可以抑制醛固酮誘導的心肌細胞肥大的發(fā)生，首次明確CaNAβmRNA發(fā)揮RNA干擾的siRNA功能片段為1053～1071片段，即CaNAβmRNA在心肌細胞肥大