pH通過AMPK調控心肌細胞自噬的分子機制研究.pdf

1、研究背景：酸堿平衡是維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定，保證細胞正常代謝與功能的前提，而受諸多因素的影響，機體pH會發(fā)生一定的波動。pH改變會引發(fā)細胞內一系列信號變化，參與多種病理生理過程的調控。例如嚴重燒創(chuàng)傷、嚴重感染、慢性腎衰及代謝性疾病等發(fā)生后，細胞產酸大于排酸，導致酸中毒，造成細胞損傷、組織臟器功能障礙。而胞漿堿化與細胞增殖密切相關，是惡性腫瘤重要特征之一。這提示pH對細胞功能狀態(tài)具有重要調控作用。
　　心臟是循環(huán)系統(tǒng)的動力器官，嚴重燒傷

2、后早期即出現(xiàn)心臟損傷。心臟受損不僅可引起心功能不全，還可進一步加重全身其它組織器官缺血缺氧性損害。因此，燒傷后心肌損害的研究具有極其重要的理論與臨床意義。既往研究表明 pH下降在介導心臟損傷中發(fā)揮重要作用，酸中毒可導致心肌興奮-收縮耦聯(lián)障礙，造成心肌收縮力減弱，還可直接損害心肌細胞超微結構造成器質性損害。但 pH如何引起心肌損傷，其發(fā)生規(guī)律及具體分子機制仍不完全清楚。
　　自噬是指溶酶體介導的胞漿物質被降解循環(huán)再利用的過程，可更新

3、細胞內衰老、變性或錯誤折疊的蛋白，清除多余或受損的細胞器，以維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。既往研究證明，自噬在心肌組織中廣泛存在，涉及到許多心臟疾病的心肌病理學過程，對于穩(wěn)定心臟結構和功能有著重要的作用。例如在缺血性心肌病、心力衰竭、心肌炎及心肌肥厚等疾病過程中，心肌細胞的自噬活動會增強。但自噬是否參與調控了 pH異常引起心肌損傷及發(fā)揮何種作用目前尚不清楚。有研究表明，細胞外 pH的改變會影響MCF-10A、MCF-7、Hela等細胞的自噬活性，

4、Marino等的研究發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境能激活人黑色素瘤細胞的自噬，從而促進細胞存活，這提示我們pH是影響細胞自噬重要因素，且具有細胞特異性。因此推測：pH是否通過調控自噬引起心肌細胞功能改變。
　　細胞自噬的誘導和調控是一個非常復雜而精密的過程，許多因素均可以誘導細胞產生自噬，如缺氧、營養(yǎng)壓力、氧化應激壓力均可激活細胞自噬，同時又有許多信號分子參與自噬的調控，如能量信號主要通過 AMPK調控自噬，絲裂原信號主要通過mTORC1影響自噬活

5、性，其他的還有 p53、beclin1等信號通路均可參與自噬的調控。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）是一種進化保守的、功能強大的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在心臟中，多種損傷如饑餓、缺血缺氧以及氧化應激等均可導致AMPK激活。活化的 AMPK在維持細胞能量代謝和細胞存活中發(fā)揮重要作用。其中，自噬就是AMPK依賴的一種重要的適應和存活機制。然而關于AMPK如何調控自噬，目前存在不同的說法。較早的研究認為AMPK活化后能夠通過抑制哺乳動物雷帕霉

6、素靶點（mTOR）活性激活自噬。隨著對AMPK功能及作用機制的研究深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn) AMPK可以直接作用于ULK1調控自噬，而且大量研究證明AMPK-ULK1是誘導自噬的關鍵。然而在酸、堿處理條件下AMPK調控心肌細胞自噬的下游信號仍不清楚。本課題旨在研究pH對心肌細胞自噬活性的影響及其相關分子機制，為 pH改變所致的心肌損傷的臨床防治提供新的思路。
　　研究方法
　　1.通過調控培養(yǎng)基 pH模擬細胞外酸、堿化條件，

7、采用 CCK8及 LDH釋放檢測酸、堿處理條件下心肌細胞活力的改變。采用蛋白免疫印記（WB）和免疫熒光（IF）檢測酸、堿處理條件下心肌細胞自噬活性的變化。然后采用熒光分子探針檢測酸、堿處理條件下溶酶體酸度的改變，進一步用巴佛洛霉素A1（Baf A1）抑制溶酶體酸化后，檢測酸、堿處理條件下自噬活性的變化。
　　2.首先采用WB檢測酸、堿處理條件下心肌細胞 AMPK活性的變化。使用重組腺病毒轉染技術構建了低表達AMPKα2的心肌細胞模

8、型。然后干預AMPK，采用WB和IF檢測酸、堿處理條件下心肌細胞自噬水平的變化。此外，采用CCK8、LDH釋放及SYTOX green檢測酸、堿處理條件下AMPK及其調控的自噬對心肌細胞活力的影響。
　　3.首先采用 WB檢測酸、堿處理條件下心肌細胞 mTORC1活性的變化。干預AMPK，采用WB檢測酸、堿處理條件下心肌細胞mTORC1活性的改變。進一步干預mTORC1，檢測其對酸、堿處理條件下心肌細胞AMPK活性及自噬水平的影響

9、。采用WB檢測了酸、堿處理條件下ULK1活性的改變。干預AMPK，檢測酸、堿處理條件下心肌細胞ULK1活性的變化。建立了低表達ULK1的心肌細胞模型。干預ULK1，采用WB和IF檢測酸、堿處理條件下心肌細胞自噬水平的變化。最后采用CCK8、LDH釋放及SYTOX green染色檢測酸、堿處理條件下ULK1及其調控的自噬對心肌細胞活力的影響。
　　結果：
　　1.酸化處理3h后，即發(fā)現(xiàn)心肌細胞活力明顯下降，且隨著處理時間的延長

10、，心肌細胞損傷加重；堿化處理后早期，細胞活力增加，持續(xù)堿化作用可導致細胞活力下降。酸化處理后，LC3-I向LC3II轉換減少；堿化處理誘導LC3-I向LC3II轉換增多。酸、堿化處理后，與自噬活性負相關的 p62蛋白表達均下降。免疫熒光顯示 LC3和LAMP1共定位良好；溶酶體檢測結果提示細胞外pH改變后6 h，溶酶體的酸度未見明顯下降；采用Baf A1處理后，酸、堿處理條件下心肌細胞LC3-II蛋白及p62蛋白均顯著積累。
　　

11、2.酸化處理抑制心肌細胞AMPK活性，堿化處理誘導心肌細胞AMPK激活。酸化處理6 h后，細胞自噬水平下降，而使用Met激活AMPK后細胞自噬水平升高，使用AMPKα2 shRNA抑制AMPK活性可逆轉Met誘導的自噬活性上調；堿化處理后6 h自噬水平升高，使用AMPKα2 shRNA抑制AMPK活性可顯著阻斷堿化處理誘導的自噬水平上調。酸化處理6 h后，心肌細胞活力下降，死細胞數(shù)目增加，而使用Met激活 AMPK和自噬活性后，酸化處理

12、誘導的細胞損傷減輕，死細胞數(shù)目減少，使用AMPKα2 shRNA抑制AMPK活性可阻斷這一效應；堿化處理6 h后，細胞活力升高，死亡細胞減少，使用AMPKα2 shRNA抑制AMPK活性后細胞活力下降，細胞死亡數(shù)目增多。
　　3.酸化處理下調心肌細胞mTORC1活性，堿化處理誘導mTORC1激活。酸、堿處理條件下，使用Met和AMPKα2 shRNA激活/抑制AMPK6 h后，mTORC1活性無明顯變化。酸、堿處理條件下，使用mE

13、GF/RAPA激活/抑制mTORC16 h后，AMPK活性和自噬水平均無顯著變化。酸化處理抑制心肌細胞 ULK1活性，堿化處理誘導ULK1激活。酸化處理6 h后，ULK1活性下降，而使用Met激活AMPK后細胞ULK1活性增強，使用AMPKα2 shRNA抑制AMPK活性可逆轉Met誘導的ULK1激活；堿化處理上調ULK1活性，使用AMPKα2 shRNA干擾后可抑制這一效應。酸化處理6 h后，自噬水平下降，而使用 Met激活 AMPK

14、和 ULK1后細胞自噬水平上調，進一步使用ULK1 shRNA抑制ULK1活性可逆轉Met誘導的自噬活性增高；堿化處理誘導自噬水平升高，使用ULK1 shRNA敲降ULK1表達可顯著阻斷這一過程。酸化處理6 h后，細胞活力下降，死亡細胞增加，而使用Met激活AMPK和自噬活性可減輕酸化誘導的細胞損傷，進一步使用ULK1 shRNA敲降 ULK1表達可阻斷這一效應；堿化處理6 h后，細胞活力升高，死亡細胞減少，使用ULK1 shRNA敲降

15、ULK1表達后細胞活力下降，細胞死亡數(shù)目增多。
　　結論：
　　1.酸化處理導致細胞損活力下降，堿化處理后早期細胞活力升高，持續(xù)作用細胞活力下降。酸化處理后，心肌細胞自噬活性明顯下降；堿化處理誘導自噬激活，酸、堿化處理后均不伴有自噬通量的損傷。
　　2. pH可調控心肌細胞AMPK的活性，AMPK介導了pH對原代心肌細胞自噬活性及細胞活力的調控。
　　3. pH可調控心肌細胞中mTORC1的活性，酸、堿處理條件下

16、，AMPK和mTORC1的相互作用不明顯，mTORC1信號通路在pH介導的心肌細胞自噬調控中不發(fā)揮主要作用。酸、堿處理條件下，ULK1可能是AMPK的重要下游靶標之一，AMPK可能通過調控ULK1信號通路介導心肌細胞自噬活性和細胞活力的改變。
　　4.酸、堿處理條件下，早期發(fā)生的細胞自噬均有保護心肌的作用，抑制自噬活化會加重心肌細胞損傷。
　　5.在嚴重燒傷抗休克治療中，如何使血液酸堿度控制在既不影響血紅蛋白釋放氧，又不影響