自噬-NF-κB環(huán)路介導(dǎo)心肌細(xì)胞抗缺血作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的:建立H9C2心肌細(xì)胞氧葡萄糖剝奪（OGD）模型模擬體內(nèi)心肌缺血，觀察自噬對(duì)氧葡萄糖剝奪處理引起H9C2心肌細(xì)胞受損的影響，并研究該過程中自噬是否通過影響 NF-κB而發(fā)揮作用，從而為揭示自噬參與抗缺血損傷的分子機(jī)制。
　　方法:通過對(duì) H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行氧葡萄糖剝奪處理，建立心肌缺血模型。采用Western-blot法和pEGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染檢測(cè)氧葡萄糖剝奪后自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和P62的表達(dá)變化情況以及

2、不同時(shí)間點(diǎn)氧葡萄糖剝奪處理后心肌細(xì)胞GFP-LC3點(diǎn)狀聚集物數(shù)目的變化；采用MTT法和臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)給予自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素對(duì)氧葡萄糖剝奪處理后心肌細(xì)胞的存活率；采用Western-blot法和免疫熒光法檢測(cè)NF-κB在自噬介導(dǎo)的心肌細(xì)胞抗缺血損傷中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.與正常對(duì)照組相比，在OGD處理0.5h到2h過程中自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)水平顯著升高，而在2h時(shí)P62蛋白水平相應(yīng)明顯下降。隨后

3、，在2h到12h過程中LC3和Beclin-1的表達(dá)水平逐漸降低，在12h時(shí)P62水平顯著升高。為了進(jìn)一步證明自噬流的情況，采用溶酶體抑制劑氯喹處理2h后OGD處理12h，發(fā)現(xiàn)OGD處理后P62明顯堆積，而給予氯喹后進(jìn)行 OGD處理對(duì) P62的水平?jīng)]有明顯變化。
　　2.對(duì)經(jīng)pEGFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的H9C2細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間的氧葡萄糖剝奪處理，在0.5h到2h之間GFP-LC3熒光斑點(diǎn)增加，自噬增強(qiáng)；在直到12h的處理時(shí)間中，G

4、FP-LC3熒光斑點(diǎn)逐漸下降到基線水平。
　　3. MTT和臺(tái)盼藍(lán)染色的結(jié)果表明，在氧葡萄糖剝奪處理的H9C2心肌細(xì)胞中，給予Rapamycin增強(qiáng)自噬可以明顯提高細(xì)胞的存活率。反之，使用3-MA或siATG5抑制自噬會(huì)顯著降低細(xì)胞存活率。
　　4. Western-blot結(jié)果顯示，增強(qiáng)自噬能夠抑制小鼠心梗后 NF-κB的磷酸化；使氧葡萄糖剝奪處理后H9C2心肌細(xì)胞中核蛋白 P65表達(dá)水平降低，胞漿蛋白 IκB-α的表達(dá)水

5、平升高。通過免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果也顯示，增強(qiáng)自噬抑制氧葡萄糖剝奪對(duì)H9C2心肌細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響。
　　5. Western-blot結(jié)果顯示，抑制 NF-κB能夠明顯上調(diào)氧葡萄糖剝奪處理4h的H9C2心肌細(xì)胞中LC3蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)到P62蛋白表達(dá)明顯下降。從免疫組化的結(jié)果中也可以看出，抑制NF-κB信號(hào)通路能夠增多GFP-LC3活性細(xì)胞和點(diǎn)狀聚集物，反過來正反饋增強(qiáng)自噬。
　　結(jié)論:給予Rapamycin增