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文檔簡(jiǎn)介
1、【研究背景】
心血管疾?。╟ardiovascular disease,CVD)是威脅人類健康的頭號(hào)殺手。心肌重塑在心臟從代償階段向失代償階段即心力衰竭(heart failure,HF)轉(zhuǎn)化中扮演重要角色,所以對(duì)于心肌重塑的干預(yù)一直是臨床治療心肌疾病和基礎(chǔ)研究心衰發(fā)生機(jī)制的重點(diǎn)。閏盤是心肌細(xì)胞間的重要連接結(jié)構(gòu)和代謝活躍區(qū)域,也是新生肌節(jié)加入的地方。閏盤重塑在心肌重塑過程中起重要作用,然而,參與閏盤重塑的蛋白及其調(diào)節(jié)因素還不清
2、楚。由于在多種心肌疾病中,心肌細(xì)胞內(nèi)都會(huì)出現(xiàn)鈣超載現(xiàn)象。鈣蛋白酶calpains是鈣依賴性蛋白水解酶,calpastatin是其內(nèi)源性抑制劑,參與Ca2+介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)生理或病理生理過程。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn) calpain-2和 calpastatin在心肌閏盤處大量分布,尚無 calpain-2和 calpastatin在閏盤處作用的相關(guān)研究。因此,本實(shí)驗(yàn)利用尾部懸吊4周模擬失重大鼠模型(4-week of tail-suspend
3、ed rats,SUS)、離體心肌局部缺血再灌注損傷模型(ischemia-reperfusion injury,I-R)、腹主動(dòng)脈縮窄(transverse abdominal aortic constriction,TAC)高血壓心肌肥厚模型等不同心臟重塑模型,比較calpain-2和 calpastatin在不同閏盤重塑過程中的異同點(diǎn),認(rèn)為 calpains可能通過調(diào)節(jié)鈣黏蛋白 N-cadherin參與維持閏盤正常結(jié)構(gòu)和新生肌節(jié)的
4、加入,在閏盤重塑中起重要的降解老蛋白質(zhì)和維持新蛋白質(zhì)合成環(huán)境的作用。
【研究目的】
(1)觀察calpain-2和calpastatin在心肌閏盤上的定位
?。?)比較對(duì)照組(CON)、SUS組、I-R組和TAC組閏盤處calpain-2和calpastatin的分布
?。?)觀察閏盤在CON組、SUS組、I-R組和TAC組中心臟重塑過程中的變化
?。?)探索calpains在閏盤重塑中的作用
5、及其底物
【研究方法】
本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光、包埋前免疫電鏡和包埋后免疫電鏡等多種方法,驗(yàn)證calpain-2和calpastatin在心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位;心肌組織冰凍切片和膠原酶消化的單個(gè)心肌細(xì)胞分別進(jìn)行免疫標(biāo)記,采用激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù),觀察 calpain-2和calpastatin在心肌組織和單個(gè)心肌細(xì)胞中的表達(dá)和定位;采用尾部懸吊4周模擬失重大鼠模型、大鼠離體局部心肌缺血再灌注損傷模型
6、和腹主動(dòng)脈縮窄高血壓大鼠心肌肥厚模型構(gòu)建不同的病理情況下心肌重塑模型;用透射電子顯微鏡技術(shù),觀察心肌重塑過程中心肌肌原纖維和閏盤的超微結(jié)構(gòu)變化;利用體外培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞的方法,通過Ca2+載體A23187提高細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度來激活calpain,或使用calpain特異性抑制劑PD150606來抑制calpain的活性;使用calpain GloTM Protease Assay檢測(cè)試劑盒熒光素酶生物發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)calpa
7、in活性的變化,以證實(shí)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞內(nèi) calpain的活性受到A23187或PD150606的調(diào)節(jié);最后用細(xì)胞免疫熒光和激光共聚焦顯微成像技術(shù),觀察N-cadherin和CX-43的表達(dá)分布情況。
【研究結(jié)果】
?。?)心肌細(xì)胞的閏盤有calpain-2和calpastatin等多種蛋白質(zhì)的分布。
免疫組織化學(xué)和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示 calpain-2在心肌細(xì)胞中呈橫紋狀分布,且在閏盤處有中等量的聚集。用閏
8、盤結(jié)構(gòu)蛋白N-cadherin、CX-43標(biāo)記閏盤位置,與calpastatin進(jìn)行免疫雙重標(biāo)記結(jié)果顯示 calpastatin在心肌細(xì)胞中散在分布,在閏盤處大量聚集。包埋前免疫電鏡和包埋后免疫電鏡進(jìn)一步確定了 calpain-2和calpasatatin在心肌超微結(jié)構(gòu)中的定位,calpain-2主要集中在 Z盤和閏盤分布,故在免疫組化和免疫熒光圖像中呈橫紋狀;calpastatin在整個(gè)心肌細(xì)胞內(nèi)都有分布,閏盤大量分布,在超微結(jié)構(gòu)上的
9、分布無明顯特征,與免疫熒光結(jié)果一致。
?。?)Calpastatin在 SUS大鼠重塑心臟中未發(fā)生明顯變化,calpain-2在 SUS大鼠心臟中明顯向心肌細(xì)胞核轉(zhuǎn)位。
尾部懸吊4周模擬失重大鼠誘導(dǎo)心臟重塑,SUS組與CON組相比,比目魚肌萎縮明顯,但心臟體重比未見明顯變化。Western blot檢測(cè)calpain-2與calpastatin的表達(dá)量,SUS組與CON組之間未見明顯差異;免疫熒光顯示calpain-2
10、和calpastatin在閏盤處的分布亦未見明顯差異,calpain-2在SUS組有明顯向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象,可能與SUS組心肌細(xì)胞凋亡易感性增加有關(guān)。
?。?)Calpastatin和 N-cadherin在離體局部缺血再灌注損傷心臟梗死區(qū)表達(dá)明顯降低。
大鼠離體局部心肌缺血再灌注損傷心臟中,利用CX-43和p-CX-43在梗死區(qū)表達(dá)降低,在正常區(qū)域內(nèi)表達(dá)正常的特點(diǎn)來定位心肌缺血再灌注損傷邊緣區(qū)域。在損傷邊緣區(qū),靠近梗
11、死區(qū)域的一側(cè)calpastatin表達(dá)明顯降低,尤其是閏盤處的分布特征完全消失,在靠近正常區(qū)域的一側(cè),calpastatin的表達(dá)和分布與正常對(duì)照組相似,無明顯變化。在梗死區(qū)域內(nèi),N-cadherin的表達(dá)明顯降低。透射電子顯微鏡觀察損傷邊緣區(qū)域閏盤的變化,發(fā)現(xiàn)正常心肌細(xì)胞中,末端肌節(jié)的肌絲與閏盤緊密相連,死亡的心肌細(xì)胞末端肌節(jié)與閏盤邊緣的距離明顯增加,肌絲與閏盤之間的連接斷裂導(dǎo)致肌節(jié)攣縮和細(xì)胞死亡。
?。?)TAC大鼠心臟閏盤
12、重塑明顯,calpain-2在閏盤處的分布明顯增加。
腹主動(dòng)脈縮窄高血壓誘導(dǎo)心肌肥厚模型中,透射電鏡顯示TAC心肌閏盤重塑明顯,4 h后即可見到大量增寬的閏盤,和新生肌節(jié)的加入;在12周之后,閏盤重塑持續(xù)存在。免疫組織化學(xué)染色顯示calpain-2在TAC心肌閏盤上的分布明顯多于CON組,calpastatin在心肌閏盤處的分布未見明顯變化。
?。?)Calpains被激活后,培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞中N-cadherin
13、表達(dá)明顯降低。
在體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞中,利用Ca2+載體A23187提高細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi) calpain的活性明顯增加,calpain抑制劑PD150606可明顯降低A23187的這一效應(yīng)。Calpain被激活后,可見培養(yǎng)心肌細(xì)胞內(nèi)新生肌原纖維裝配量明顯降低,N-cadherin的表達(dá)量明顯減少,但是CX-43的表達(dá)及分布未見明顯變化。PD150606可明顯抑制N-cadherin的降解。
14、> 【研究結(jié)論】
本研究采用免疫組織化學(xué)、免疫熒光、免疫電子顯微鏡技術(shù)從多個(gè)層面驗(yàn)證了calpain-2和 calpastatin在心肌細(xì)胞內(nèi)的分布,證實(shí)了calpain-2和calpastatin在閏盤處的定位;通過建立尾部懸吊模擬失重大鼠、離體心臟局部缺血再灌注損傷和腹主動(dòng)脈縮窄高血壓心肌肥厚等模型,觀察不同心肌重塑過程中閏盤的重塑特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)在肥大心肌細(xì)胞生長(zhǎng)過程中,閏盤是新生肌節(jié)加入的地方,并且calpain和calp
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