Calpain-2核轉(zhuǎn)位介導肥大心肌細胞凋亡.pdf

1、【引言】
　　長期慢性高血壓可引起心肌肥厚，早期呈代償性心肌收縮力增強，隨著心室的重構(gòu)，心肌肥厚就會向心衰轉(zhuǎn)化。心肌細胞的凋亡在其中扮演著重要角色，甚至在代償性心肌肥厚早期，肥大的心肌細胞在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的作用下凋亡率就會增高，即肥大的心肌細胞凋亡易感性升高，但是其具體機制尚不清楚。探討肥大心肌細胞凋亡易感性增加的機制可為預防心肌肥厚向心衰轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。研究證實心肌細胞在肥大的過程中鈣依賴性蛋白酶（calpain）活

2、性增加，促進肌節(jié)蛋白的更新；同時鈣/鈣調(diào)蛋白激酶ⅡδB活性增高，促進肌節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄與合成，二者共同作用促進心肌細胞的肥厚。我們在實驗中觀察到在肥大的心肌細胞中calpain-2向細胞核轉(zhuǎn)位，可能參與調(diào)節(jié)肥大心肌細胞的凋亡。因此，本實驗利用腹主動脈縮窄高血壓大鼠模型來模擬高血壓性心肌肥厚，比較了肥大心肌細胞與正常大鼠心肌細胞的異同點，認為calpain-2被激活核轉(zhuǎn)位降解CaMKⅡδB可能是肥大心肌細胞凋亡易感性增加的分子機制之一。

3、>　　【目的】
　　1、制作腹主動脈縮窄高血壓大鼠模型（TAC）并觀察心肌肥厚情況。
　　2、觀察AngⅡ?qū)ON組和TAC組心肌細胞凋亡率的影響。
　　3、觀察CON組與TAC組心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。
　　4、觀察CON組與TAC組心肌細胞內(nèi)calpain-2定位、活性的變化。
　　5、觀察CON組與TAC組心肌細胞核內(nèi)CaMKⅡδB的變化。
　　6、觀察CON組與TAC組心肌細胞內(nèi)Bcl-

4、2的表達變化情況以及線粒體膜電位和細胞色素c的釋放情況。
　　【方法】
　　本實驗采用腹主動脈縮窄高血壓大鼠模型模擬長期慢性后負荷增加導致的心肌肥厚，用心臟B超觀察心肌肥厚程度和心功能的變化，原位凋亡檢測心肌細胞凋亡率，用鈣熒光探針Fluo3/AM標記細胞內(nèi)游離的Ca2+，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察Ca2+濃度的變化，細胞免疫熒光技術和WesternBlot技術檢測calpains、CaMKⅡδB、Cytoc等蛋白質(zhì)的定位和表

5、達情況。用免疫共沉淀技術檢測calpain-2和CaMKⅡδB之間的相互關系。用Real-TimePCR檢測左心室心肌中Bcl-2mRNA的表達水平。用線粒體膜電位熒光探針JC-1結(jié)合激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位的變化。細胞免疫熒光結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術觀察Cytoc的分布形式來反映Cytoc的釋放情況，線粒體內(nèi)的Cytoc呈規(guī)則的顆粒狀分布。
　　【結(jié)果】
　　1、腹主動脈縮窄16w大鼠心肌出現(xiàn)肥厚，凋亡易感性明顯增

6、加
　　采用心臟B超觀察模型組心肌肥厚程度，顯示腹主動脈縮窄16w后心臟室間隔和后壁明顯肥厚，短軸縮短率（FS）增大，射血分數(shù)（EF）升高，心臟呈現(xiàn)代償性肥厚。TUNEL法原位檢測心肌細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)TAC組心肌細胞凋亡率并未明顯高于CON組；經(jīng)AngⅡ作用后，TAC組凋亡率則明顯高于CON組；鈣蛋白酶（calpain）抑制劑PD150606則能明顯抑制AngⅡ的凋亡誘導作用。
　　2、肥大心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度升高

7、　　Fluo3/AM熒光探針標記細胞內(nèi)游離Ca2+，在電場刺激心肌細胞收縮的同時，用激光共聚焦顯微鏡掃描記錄鈣瞬變時Fluo3熒光強度的變化。在CON組中，核內(nèi)與胞漿內(nèi)的Ca2+濃度無明顯差異，AngⅡ可明顯提高CON組中細胞核內(nèi)的Ca2+濃度；在TAC組中，細胞漿與細胞核內(nèi)Ca2+濃度都明顯高于CON組，AngⅡ使細胞內(nèi)的Ca2+濃度進一步升高。
　　3、肥大心肌細胞中calpain-2活性升高，向細胞核轉(zhuǎn)位明顯
　　心肌

8、細胞免疫熒光染色，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察calpains在心肌細胞亞細胞的分布和定位情況。Calpain-1和calpastatin主要分布于細胞漿。Calpain-2除分布于胞漿外，在核膜周圍或核內(nèi)有少量分布，AngⅡ作用后，核內(nèi)分布有增多的趨勢，在TAC組中，核轉(zhuǎn)位的calpain-2明顯增多。將細胞漿蛋白和細胞核蛋白分離出來，用Westernblot技術檢測各組分中calpains的變化，發(fā)現(xiàn)calpain-1和calpasta

9、tin主要分布于細胞漿組分，但是calpain-2在AngⅡ作用的TAC組心肌細胞核內(nèi)表達明顯增多，不但calpain-2的整體活性增強，而且核內(nèi)calpain-2大部分是被激活的，因為核內(nèi)沒有calpastatin的抑制作用，calpain-2的活性比胞漿內(nèi)更高。
　　4、核轉(zhuǎn)位的calpain-2激活后降解CaMKⅡδB
　　用Westernblot技術檢測細胞核內(nèi)的CaMKⅡδB的表達情況，發(fā)現(xiàn)隨著核內(nèi)calpain-

10、2的增多和活性的增強，CaMKⅡδB的表達減少。免疫共沉淀實驗證實TAC組經(jīng)AngⅡ作用后，細胞核內(nèi)的calpain-2與CaMKⅡδB的相互作用增加，提示CaMKⅡδB可能是激活的calpain-2的底物蛋白，calpain-2調(diào)節(jié)CaMKⅡδB的表達。
　　5、Bcl-2表達減少，線粒體凋亡通路容易被激活
　　Real-TimePCR檢測細胞內(nèi)凋亡抑制因子Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄情況，證實TAC組大鼠心臟在AngⅡ的作用下B

11、cl-2的mRNA表達水平明顯減少；WesternBlot結(jié)果顯示TAC組Bcl-2的蛋白表達明顯減少，在AngⅡ的刺激下Bcl-2的表達進一步降低。同時觀察到，在該組中，線粒體膜電位明顯降低，CytoC向胞漿內(nèi)的釋放增多，線粒體凋亡通路被激活。
　　【結(jié)論】
　　本研究利用腹主動脈縮窄高血壓大鼠模型模擬長期后負荷增加導致的心肌肥厚，在腹主動脈縮窄16w后，心臟室間隔和后壁明顯肥厚，左心室內(nèi)徑縮小，心肌收縮功能增強。肥大的心

12、肌細胞中，細胞漿和細胞核內(nèi)的Ca2+濃度增加，calpain-2的活性增加，并且向細胞核轉(zhuǎn)位；在AngⅡ刺激作用下，核內(nèi)的Ca2+濃度進一步升高，calpain-2活性增強，且沒有calpastatin的抑制，活化的calpain-2降解CaMKⅡδB，引起凋亡抑制因子Bcl-2轉(zhuǎn)錄和表達減少，細胞抗凋亡的能力降低，從而使線粒體凋亡通路容易被激活，導致肥大心肌細胞凋亡易感性增加。本研究初步闡述了calpain-2核轉(zhuǎn)位介導肥大心肌細胞凋