新生鼠缺氧缺血性腦損傷后心肌calpain-1表達與心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系研究.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)是圍生期新生兒窒息引起的腦損傷,是新生兒死亡和導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的常見因為。HIBD發(fā)病機制復(fù)雜,缺氧是基礎(chǔ)病理生理改變,血流動力學(xué)紊亂是并發(fā)多臟器功能衰竭的主要因為。由缺氧引起的HIBD是一個全身性病理過程,缺氧、酸性代謝產(chǎn)物蓄積導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量代謝障礙,ATP減少,引起心肌損傷；目前對缺氧引發(fā)心肌損傷的研究表明,心肌細(xì)胞除發(fā)生壞死外還發(fā)生凋

2、亡,且在缺氧、缺血早期凋亡細(xì)胞數(shù)多于壞死細(xì)胞。Calpains家族是一類存在于細(xì)胞質(zhì)中的鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶,底物眾多,Calpain的活化參與了HIBD的發(fā)生過程,其對心肌細(xì)胞凋亡的作用主要表現(xiàn)在對凋亡途徑的調(diào)節(jié),并對某些凋亡相關(guān)基因的激活至關(guān)重要。
　　 目的:
　　 本研究采用新生7日齡Wistar大鼠構(gòu)建缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型,觀察缺氧缺血(HI)對新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響情況,同時檢測心肌組織中C

3、alpain-1mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達；凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Fas及Caspase-3mRNA表達的變化規(guī)律,以進一步探討Calpain-1、凋亡相關(guān)基因與心肌細(xì)胞凋亡之間的相互關(guān)系。
　　 方法：
　　 采用改良的Rice法建立新生大鼠HIBD模型。新生7天大鼠64只,隨機分為假手術(shù)對照組和HI后2、12、24h、2、3、5及7d組,每組各8只大鼠。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測大鼠心肌

4、組織中Calpain-1、Bcl-2、Bax、Fas及Caspase-3mRNA的表達；Westernblot法觀察大鼠心肌組織中Calpain-1蛋白活性的表達情況；脫氧核糖核酸未端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測凋亡細(xì)胞的變化,并計算細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。
　　 結(jié)果：
　　 1.新生大鼠HI后2h開始凋亡細(xì)胞增多,12h～3d各時點凋亡率明顯高于對照組(p<0.01),3d為凋亡的高峰；5d時有所降

5、低,7d仍高于對照組。
　　 2.與對照組相比,HI后12h心肌組織中Calpain-1mRNA開始增高,2d達到高峰(P<0.01),3d～5d表達量下降,但仍顯著高于對照組(P<0.01)；Calpain-1裂解為76和80兩個片段,兩者的比值在HI后2h增高(P<0.05),24h～2d顯著增高(p<0.01),3d達到高峰；5d時比值有所下降,7d時與對照組相比無差異。Calpain-1蛋白活性(76KD/80KD)與細(xì)

6、胞凋亡率相關(guān)(r=0.853；p<0.01)。
　　 3.與對照組相比,HI組BaxmRNAHI后2h開始增高,2d達到高峰,3d～5d開始降低；HI組Bcl-2mRNA表達在HI后2h開始降低,12h～24h基因的表達顯著降低(p<0.01),2d時達到最低水平后又開始逐漸增高,7d時與對照組相比無差異。HI組Bcl-2/Bax比值自2h逐漸降低,2d為最低點,3d～5d比值又逐漸增高,7d時與對照組持平,無統(tǒng)計學(xué)意義。Bcl

7、-2/Bax比值與細(xì)胞凋亡率負(fù)相關(guān)性(r=0.601；p<0.01)4.HI組Caspase-3mRNA表達水平自HI后HI后2h增高,12h～2d增加顯著(p<0.01),2d時達到高峰；3d～5d時降低,但是依然高于對照組水平(p<0.01),7d時與對照組無差異。
　　 5.與對照組相比,FasmRNA自HI后2h出現(xiàn)增高(p<0.01),12h～2d表達顯著增加,與對照組相比差異顯著(p<0.01),3d時達到高峰；5d

8、時降低,7d時依然高于對照組水平(p<0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.HIBD新生大鼠心肌細(xì)胞確實存在凋亡,HI后3d為凋亡的高峰。
　　 2.新生大鼠HI后心肌組織Calpain-1mRNA及蛋白質(zhì)水平顯著增高,與對照組相比差異明顯,提示Calpain-1可能參與了缺氧缺血后心肌損傷的發(fā)生。
　　 3.HI后心肌組織Bax基因表達上調(diào),Bcl-2基因表達下調(diào),隨著細(xì)胞凋亡率的增加,Bcl-2/Ba