心脈隆對缺氧缺血性腦損傷模型新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機制的研究.pdf

1、目的:
　　 1、觀察缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型新生大鼠心肌損傷及細(xì)胞凋亡情況。
　　 2、研究心脈隆(xinmailong,XML)對缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型新生大鼠心肌損傷及細(xì)胞凋亡的影響,及其與磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路活化的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1、新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型制作及分組:128只新生7d齡SD大鼠隨機分為4組(每組32只):1.

2、假手術(shù)對照組(Sham組)；2.缺氧缺血性腦損傷模型對照組(HIBD組)；3.HIBD+心脈隆組(XML組):4.HIBD+XML+特異性PI3K阻滯劑LY294002組(LY組)。結(jié)扎實驗鼠左頸總動脈后吸入8％濃度氧2.5h制成HIBD模型。Sham組僅游離出左頸總動脈,不結(jié)扎,縫合皮膚,不缺氧；HIBD組缺氧缺血(HI)后不給于任何藥物進行干預(yù):XML組于HIBD模型建立后迅速取出大鼠,復(fù)氧30min后給與5mg/kgXML注射液腹

3、腔注射(i.p)；LY組則先后給與LY294002(0.3mg/kg ip)及XML注射液(5mg/kg ip),兩種藥物給藥間隔時間為1.5min。各組均于HI后24h、48h、72h、7d四個時間點(每個時間點各8只)分批取血及心肌組織進行各項指標(biāo)的檢測。
　　 2、觀察各組實驗大鼠實驗過程中一般表現(xiàn)及存活情況,并計算其存活率及7d體重增長值:測定血清心肌酶CK、LDH水平；HE染色后光鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變；Hoe

4、chst33258熒光染色及TUNEL法分別定性和定量檢測心肌細(xì)胞凋亡；S-P免疫組織化學(xué)法測定PI3K、p-Akt信號蛋白表達。
　　 結(jié)果:
　　 1、一般表現(xiàn):Sham組實驗過程中無明顯變化,其余3組實驗鼠置于缺氧環(huán)境5-10分鐘后開始躁動不安,15-20分鐘后活動減少,均趴伏于容器一角,并相繼出現(xiàn)不同程度的缺氧癥狀；恢復(fù)通氣后短時間內(nèi)可出現(xiàn)頭向結(jié)扎側(cè)旋轉(zhuǎn)爬行等行為學(xué)改變。
　　 2、存活率:Sham組存活

5、率為100％(32/32)；HIBD組存活率為87.50％(28/32)；XML組存活率為93.75％(30/32),LY組存活率為81.25％(28/32)。各組間存活率比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 3、7d體重增長值:HIBD組實驗大鼠體重增長較緩慢,7d體重增長值(為14日齡體重-7日齡體重)顯著落后于Sham組(P<0.01),XML組較HIBD組實驗大鼠7d體重增長值顯著增加(P<0.01),但仍明顯落

6、后于Sham組(P<0.01),LY組與其余3組比較實驗大鼠7d體重增長值均顯著滯后(P<0.01)。
　　 4、血清心肌酶CK、LDH水平:Sham組各時間點CK、LDH濃度無明顯變化(P>0.05)；其余3組上述指標(biāo)均于HI后24小時開始升高,72小時達到高峰,之后逐漸下降,持續(xù)至7d仍顯著高于Sham組(P<0.01),各時間點之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01):相同時間點:XML組CK、LDH水平顯著低于HIBD組

7、(P<0.01),LY組CK、LDH水平與HIBD組及XML組比較均顯著升高(P<0.01)。
　　 5、心肌組織病理改變:HE染色、光學(xué)顯微鏡下觀察可見Sham組大鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則,組織間無水腫,結(jié)構(gòu)完整,胞漿中橫紋清楚,細(xì)胞質(zhì)均勻淡染,細(xì)胞核致密清晰可見；HIBD組及LY組均可見心肌細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞水腫明顯,心肌間質(zhì)出血,部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死,核消失,細(xì)胞呈空泡樣,心肌纖維成波浪狀改變,但細(xì)胞凋亡不明顯。(上述改變以LY組H

8、I后72h最為顯著)；相同時間點:XML組上述改變較HIBD組及LY組均明顯減輕,心肌間質(zhì)出血及細(xì)胞壞死不明顯。
　　 6、心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變:Hochst33258染色,熒光顯微鏡下觀察可見Sham組細(xì)胞核邊界規(guī)則整齊,染色均勻并淡染呈正常的藍色；其余3組均可見凋亡染色陽性細(xì)胞,數(shù)目多少不一,以LY組HI后72h最為多見,表現(xiàn)為細(xì)胞核致密濃染、皺縮、碎裂、顏色透亮有些發(fā)白；相同時間點:XML組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)較HIBD組及L

9、Y組均明顯減少。
　　 7、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)結(jié)果分析:Sham組各時間點均僅見散在凋亡細(xì)胞；其余3組AI均于HI后24h開始升高,72h達到高峰,持續(xù)至7d時仍高于Sham組(P<0.01),各時間點之間比較有明顯差異(P<0.01)。相同時間點:XML組與HIBD組相比AI明顯降低(P<0.01)；LY組AI水平與HIBD組及XML組比較均顯著升高(P<0.01)。
　　 8、心肌組織PI3K、p-Akt信號蛋

10、白表達:
　　 8.1、心肌組織P13K信號蛋白表達:各組均可見PI3K蛋白表達陽性信號。相同時間點:各組間比較均無顯著性差異(P>0.05)；相同處理組:各時間點之間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 8.2、心肌組織p-Akt信號蛋白表達:Sham組p-Akt蛋白呈弱陽性表達,組內(nèi)各時間點之間無顯著性差異(P>0.05)；而HIBD組、XML組p-Akt蛋白表達水平均明顯增高,且均于HI后24h表達最為明顯,

11、之后逐漸下降,持續(xù)至7d仍高于Sham組(P<0.01),組內(nèi)各時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。相同時間點:XML組與HIBD組比較p-Akt蛋白表達水平進一步顯著升高(P<0.01)；LY組p-Akt蛋白表達水平與HIBD組、XML組相比均明顯降低(P<0.01),與對照組相比,則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；LY組各時間點之間比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　 9、心肌組織PI3K、p-Akt與AI之間

12、進行相關(guān)性分析:p-Akt表達與AI呈明顯負(fù)相關(guān)性(r=-0.883,P<0.001),而。PI3K與AI之間無明顯相關(guān)性(r=-0.150,P>0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、新生大鼠HIBD后早期心肌細(xì)胞即可出現(xiàn)一定程度的損傷及凋亡,以HI后72h最為明顯,持續(xù)至HI后7d仍可見異常損傷及凋亡細(xì)胞。
　　 2、PI3K/Akt信號途徑可能參與了HIBD模型建立本身所啟動的自我保護機制,從而發(fā)揮一定程度的