慢病毒介導(dǎo)的Sema3A基因轉(zhuǎn)染對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：凋亡是急性心梗中心肌細(xì)胞的損傷形式之一，可能導(dǎo)致梗死面積的擴(kuò)大和繼發(fā)性心室重塑。信號(hào)素3A(Sema3A)是信號(hào)素家族（Semaphorins）的重要成員之一，其功能復(fù)雜涉及神經(jīng)排斥，細(xì)胞遷移，分化以及誘導(dǎo)凋亡等諸多方面。在這一實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)了原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中是否含有Sema3A，以及缺氧損傷后的心肌細(xì)胞Sema3A表達(dá)的改變，并通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染改變心肌細(xì)胞Sema3A表達(dá)，研究了其對(duì)原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　

2、 方法：使用原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,分別進(jìn)行30min，2h，5h，12h，24h缺氧(1％ O2)處理，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Real time PCR）和蛋白免疫印跡法(Western Blot)兩種方式，檢測(cè)不同時(shí)間缺氧損傷對(duì)細(xì)胞Sema3A的表達(dá)的影響。設(shè)計(jì)構(gòu)建能夠用于心肌細(xì)胞的過(guò)表達(dá)和抑制Sema3A表達(dá)的慢病毒，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Real time PCR）和蛋白免疫印跡法(Western Blot)對(duì)慢病毒效

3、果進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞分為對(duì)照組，空病毒組(只攜帶GFP)，過(guò)表達(dá)/抑制病毒組(既攜帶GFP,又?jǐn)y帶目的基因)。過(guò)表達(dá)Sema3A病毒轉(zhuǎn)染后，蛋白免疫印跡法檢測(cè)Cleaved caspase-3表達(dá)，缺口末端標(biāo)記法（Tunel）檢測(cè)凋亡率。抑制Sema3A病毒轉(zhuǎn)染后，經(jīng)過(guò)兩小時(shí)的缺氧處理，Western Blot檢測(cè)Cleaved caspase-3表達(dá)，Tunel檢測(cè)凋亡率。
　　 結(jié)果：①原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞中含有Sema3A。

4、發(fā)現(xiàn)不論是Mrna還是蛋白水平，隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)(0h/0.5h/2h/5h/12h/24h)，原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞的Sema3A表達(dá)逐漸下降（Mrna: 1.0vs0.900±0.273 vs0.721±0.128 vs0.497±0.112 vs0.072±0.024 vs0.058±0.020, 0.5h/2h P＞0.05, 5h/12h/24h P＜0.05;蛋白：0.451±0.130 vs0.450±0.101 vs0.

5、444±0.106 vs0.355±0.087 vs0.260±0.068 vs0.205±0.075，0.5h/2h/5h P＞0.05，12h/24h P＜0.05)。②構(gòu)建的慢病毒能夠從Mrna和蛋白水平有效改變?cè)囵B(yǎng)的心肌細(xì)胞Sema3A的表達(dá)（Mrna水平：過(guò)表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染后，相對(duì)于對(duì)照組：空病毒組0.752±0.135，P＞0.05；過(guò)表達(dá)病毒組：33.670±3.840，P＜0.01；抑制病毒轉(zhuǎn)染后，相對(duì)于對(duì)照組：空病毒組

6、0.892±0.125，P＞0.05；抑制病毒組：0.179±0.052，P＜0.05），（蛋白水平：過(guò)表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染后：對(duì)照組0.484±0.060；空病毒組：0.589±0.072，P＞0.05（相對(duì)于對(duì)照組）；過(guò)表達(dá)病毒組：1.003±0.130，P＜0.05（相對(duì)于對(duì)照組）；抑制病毒轉(zhuǎn)染后：對(duì)照組0.895±0.084；空病毒組：0.723±0.072，P＞0.05（相對(duì)于對(duì)照組）；抑制病毒組：0.373±0.032，P＜0.05

7、（相對(duì)于對(duì)照組））。③通過(guò)增加細(xì)胞Sema3A表達(dá)，Cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào)（對(duì)照組：0.542±0.102；空病毒組：0.650±0.098；過(guò)表達(dá)病毒組：1.674±0.246，P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著增加(對(duì)照組：0.672％±0.055％；空病毒組：0.854％±0.164％；過(guò)表達(dá)病毒組：23.458％±8.656％，P＜0.05）。抑制心肌細(xì)胞Sema3A的表達(dá)后進(jìn)行缺氧2小時(shí)處理，Cleaved c

8、aspase-3表達(dá)下調(diào)（對(duì)照組：1.453±234；空病毒：1.567±0.431；Sema3A病毒：0.752±0.112，P＜0.05），細(xì)胞凋亡率下降(對(duì)照組：15.892％±1.342％；空病毒：17.620％±1.587％；Sema3A病毒：5.478％±0.958％，P＜0.05）。
　　 結(jié)論：我們的結(jié)果提示原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞能夠表達(dá)Sema3A,在受到缺氧損傷后，心肌細(xì)胞中Sema3A表達(dá)逐漸下調(diào)。我們?cè)谠?/p>