納米材料作為心肌細(xì)胞siRNA遞送載體及對(duì)閏盤組裝發(fā)育影響的研究.pdf

1、目的:
　?。ㄒ唬┩ㄟ^體外及體內(nèi)研究驗(yàn)證基于單壁碳納米管(SWNTs)的siRNA載體沉默Caspase3對(duì)急性梗死(AMI)早期細(xì)胞凋亡及心功能的影響;
　　（二）評(píng)估納米金顆粒(AuNP)/膠原(Col)復(fù)合材料對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞(NRVM)閏盤(ID)組裝及功能成熟的影響，并探討AuNPs調(diào)控ID組裝的分子機(jī)制。
　　方法:
　　（一）構(gòu)建SWNTs與siRNA復(fù)合載體F-CNT-siCas3，通過west

2、ern blotting、RT-PCR等評(píng)估其對(duì)體外培養(yǎng)NRVM目的基因表達(dá)的影響;通過超聲，Tunel染色等評(píng)估其對(duì)AMI大鼠早期凋亡、心功能的影響;
　?。ǘ┎捎迷恿︼@微鏡(AFM)、透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)、電化學(xué)工作站等表征AuNP/Col復(fù)合材料特性;采用live-dead、阿爾瑪藍(lán)染色等評(píng)估復(fù)合材料的生物相容性;從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及功能上分別評(píng)估各組心肌細(xì)胞ID相關(guān)蛋白在不同時(shí)間點(diǎn)(3d、7d、14

3、d)的表達(dá)、分布及組裝情況;采用免疫熒光染色、western blotting、RT-PCR等方法探究β1-整合素信號(hào)通路在AuNPs調(diào)控ID成熟及功能發(fā)揮中的作用。
　　結(jié)果:
　　（一）western blotting、RT-PCR結(jié)果表明與對(duì)照組相比，F(xiàn)-CNT-siCas3降低了NRVM的Caspase3表達(dá);超聲，Tunel染色等結(jié)果表明F-CNT-siCas3可減輕AMI大鼠早期細(xì)胞凋亡，改善心功能;
　　

4、（二）SEM檢測(cè)結(jié)果表明低濃度AuNP在Col溶液中分散更為均勻;AFM檢測(cè)表明材料的粗糙度隨AuNPs濃度的增加而增加;電化學(xué)工作站檢測(cè)顯示AuNPs濃度與復(fù)合基質(zhì)的電阻抗呈負(fù)相關(guān);Live/Dead染色及阿爾瑪藍(lán)染色結(jié)果提示:當(dāng)AuNPs濃度為0.1 mmol/L時(shí)材料對(duì)細(xì)胞活力的影響最小且有較好的促細(xì)胞增殖作用;TEM、及western blotting結(jié)果表明:AuNP/Col組NRVM細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的伸展、肌節(jié)發(fā)育情況均明顯優(yōu)

5、于Col組，且AuNPs可顯著增強(qiáng)ID相關(guān)蛋白(Cx43、PKP2、PG和N-cadherin)的表達(dá)，尤其加速縫隙連接蛋白Cx43蛋白的極化;鈣瞬變結(jié)果顯示AuNPs/Col組Ca2+的釋放節(jié)律性更顯著，并形成更大幅度的一致性收縮;β1-整合素阻斷實(shí)驗(yàn)表明β1-整合素抗體同時(shí)阻斷了縫隙連接蛋白Cx43和力學(xué)連接蛋白N-cadherin的表達(dá)。western blotting檢測(cè)兩組細(xì)胞3、7和14d時(shí)的p-FAK、Src和ILK的蛋白

6、表達(dá)情況，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組ILK在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組。進(jìn)一步通過Western blotting檢測(cè)兩組心肌細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)p-AKT等蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組p-AKT在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，而其余蛋白無明顯變化;p-AKT信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，呈線性斑塊分布于心肌細(xì)胞間區(qū)域的Cx43蛋白顯著減少。相反，添加β-catenin的信號(hào)阻斷劑IWP-2后，未抑制Cx43蛋白的表達(dá)及分布。而添加這

7、兩種阻斷劑對(duì)心肌細(xì)胞間N-cadherin表達(dá)無影響。
　　結(jié)論:
　?。ㄒ唬┗赟WNTs的F-CNT-siCas3載體有效沉默了Caspase3表達(dá)，并可減少AMI大鼠早期細(xì)胞凋亡，改善心功能，為CNTs用于心肌基因治療提供了新的思路;
　?。ǘ〢uNP/Col復(fù)合基質(zhì)具有良好的生物相容性，且基于AuNPs的膠原復(fù)合基質(zhì)可促進(jìn)NRVM中ID的形成、組裝和功能成熟。β1-整合素/ILK/p-AKT信號(hào)通路在AuNP