質(zhì)粒介導RNAi抑制大鼠心肌細胞KCNJ2基因表達的實驗研究.pdf

1、研究背景：目前電子心臟起搏器的植入仍然是治療病竇綜合征和房室阻滯的主要方法，但在人工心臟起搏器的應用過程中，也暴露出來一些缺陷和問題，包括：電極斷裂、絕緣性的破壞、感染、更換電池時需重新手術(shù)及靜脈血栓形成等。此外，一些有高危感染傾向和年齡太小的患者均不適合安裝電子心臟起搏器。近年來，隨著分子生物學的進展，人們正試圖發(fā)展人類自己的生物起搏器。目前心臟生物起搏的研發(fā)策略主要有基因治療和細胞治療。細胞治療主要是利用于細胞(胚胎干細胞、骨髓間充

2、質(zhì)干細胞)和竇房結(jié)細胞，但目前存在免疫排斥，定向分化，瘤生成和倫理等問題。基因治療集中以下三種方法：(1)過度表達神經(jīng)激素(特別是腎上腺素)受體增加心房電活動。(2)通過過度表達起搏電流(HCN2)基因。(3)替換內(nèi)向整流鉀離子通道成孔部位的3個氨基酸殘基，構(gòu)建一個顯性失活突變體，減少超極化電流，從而增加心室細胞的起搏活動。其中前兩種方法，在動物實驗中表現(xiàn)出較低頻率的生物起搏心律，難以滿足心臟起博的需要。近年研究發(fā)現(xiàn)，成人心室肌細胞具有

3、潛在的起搏活性，但是受到內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)抑制，Ikl鉀通道是由KCNJ2基因家族編碼的，它在心房和心室高度表達，而竇房結(jié)細胞缺乏這種電流。Ikl具有很強的內(nèi)向整流特性，穩(wěn)定靜息電位于負值的作用。最近Si1vaJ和RudyY等研究發(fā)現(xiàn)心室肌細胞的Ik1電流抑制達81％以后就表現(xiàn)出自發(fā)性的動作電位，而且隨著Ik1電流抑制率的增加心室肌細胞內(nèi)在的起搏頻率也增加。2002年Miake等報道用負顯性法抑制心室細胞的Ik1電流，在沒有抑制迷

4、走神經(jīng)的情況下在豚鼠心臟誘導出了起源于心室的自發(fā)性起搏心律，心率比竇房結(jié)快，并且這種心室肌細胞還對β受體激動劑有反應，這一研究為生物起搏的概念提供了證據(jù)。動物實驗表明完全阻斷KCNJ2基因表達，可導致其他畸形出現(xiàn)。為此，我們設計了應用RNA干擾方法抑制KCNJ2基因表達的實驗研究，以便為應用RNA干擾方法制造生物起搏器奠定實驗基礎。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指雙鏈RNA(dsRNA)誘導同源mR

5、NA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平導致基因靜默的過程。RNA干擾現(xiàn)象最仞在線蟲中發(fā)現(xiàn)，近來，隨著對RNA干擾過程的進一步了解，人們已經(jīng)能夠利用合成的 siRNAs(small interference RNA)或載體表達的siRNAs誘導哺乳動物細胞特定的基因靜默。RNAi是一種有效的分子生物學實驗技術(shù)，抑制目的基因表達具有高特異性、高度穩(wěn)定性，并且shRNA(short hairpin interference RXA)的干擾效果比siRN

6、A好。RNAi的實施程序：(1)選擇靶基因(2)選擇靶位點(3)選擇基因功能檢測方法(4)篩選有效干擾靶位點(5)構(gòu)建載體用于基因治療。一般建議設計5個序列進行篩選。本研究中我們首先構(gòu)建5個針對大鼠心肌細胞KCNJ2 mRNA的 shRNA的真核表達載體，然后用該載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的大鼠心室肌細胞，通過定量RT-PCR和Western-blot檢測大鼠心肌細胞KCNJ2基因表達的抑制情況，并應用膜片鉗技術(shù)觀察KCNJ2基因抑制后，大鼠心肌細胞

7、內(nèi)向整流鉀電流的變化。為應用RNA干擾技術(shù)在大鼠活體制造生物起搏器提供實驗依據(jù)。應用RNA干擾技術(shù)制造生物起搏器的研究在國內(nèi)外尚未見報道。本研究共分四部分： 第一部分 新生大鼠心肌細胞的培養(yǎng)和活力觀察 研究目的：獲得高純度具有活力的大鼠心室肌細胞，為后續(xù)實驗提供實驗模型。 研究方法：應用0.08％胰酶，0.05％Ⅰ型膠原酶消化分離心肌細胞，通過兩次差速貼壁和添加BrdU來提高心肌細胞純度，用抗a-actin

8、和抗myosin的特異抗體進行細胞免疫組化，測定心肌細胞純度，分別在培養(yǎng)的第3，6，9天于倒置顯微鏡下隨機計數(shù)10個心肌細胞的搏動頻率，觀察培養(yǎng)細胞的活力。研究結(jié)果：即刻細胞存活率達95％以上，心肌細胞的純度接近95％，3，6，9天培養(yǎng)細胞的活力無差異。 第二部分 大鼠心肌細胞基因KCNJ2 mRNA特異性shRNAs 真核表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染效率的觀察 研究目的：構(gòu)建5個針對大鼠心肌細胞基因KCNJ2 m

9、RNA特異性shRNA真核表達載體并觀察轉(zhuǎn)染心肌細胞效率。 研究方法：文獻查找大鼠KCNJ2基因mRNA的序列。依據(jù)設計原則最終選定五個特異性靶位點(含19bp)，分別針對其編碼區(qū)＋109～＋117、＋361～＋379、＋926～＋934、＋1156～＋1174、＋1176～＋1194位堿基。合成5對相應的寡核苷酸鏈，形成雙鏈后分別將其連入帶有U6啟動子的雙鏈閉環(huán)DNA pGenesil質(zhì)粒，該載體可同時表達GFP。重組質(zhì)粒進行

10、酶切鑒定和測序。 胰蛋白酶消化分離心肌細胞，通過兩次差速貼壁和添加BrdU來提高心肌細胞純度，按脂質(zhì)體體積和質(zhì)粒Pgene s il(命名為HE) 重量配制3∶1的轉(zhuǎn)染液，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24h、48h、72h的心肌細胞。用流式細胞儀測定細胞轉(zhuǎn)染率。 研究結(jié)果：1．構(gòu)建的各重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測序證實構(gòu)建成功，無任何堿基突變。2．轉(zhuǎn)染后72h流式細胞儀測得Pgenesil-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24h、48h、72h的心肌細胞效率(p

11、＜0.05)，依次為：36.63％±2.71％、19.54％±2.37％、12.73％±2.67％。 第三部分 RNA干擾抑制KCNJ2基因表達的效果觀察研究目的：1．建立KCNJ2 mRNA的實時熒光定量檢測方法。2．應用建立的方法，在mRNA水平觀察RNA干擾KCNJ2基因的表達情況，western Bloting檢測蛋白Kir2.1的表達抑制情況。3．確認針對KCNJ2基因mRNA 5個靶位點的中沉默效果最明顯的位點

12、，為下一步構(gòu)建腺病毒表達載體進行體內(nèi)實驗做前期準備。研究方法：提取大鼠心肌細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴增KCNJ2和βactin的片段，PCR擴增片段構(gòu)建重組質(zhì)粒，作為標準品，優(yōu)化實時熒光定量PCR的條件。采用樣點擬合法分析結(jié)果得到標本中KCNJ2和β—actin的Ct值。隨機抽取l份標本重復5管，估計批內(nèi)變異系數(shù)(CV)。在不同時間點對同1份標本重復檢測4次，以估計批間變異系數(shù)(CV)。 將培養(yǎng)的新生Wistar大鼠

13、心肌細胞分為三組：(1)干擾組：轉(zhuǎn)染表達shRNAs質(zhì)粒載體(LYS1、LYS2、LYS3、LYS4、LYS5)；(2)陰性對照組：轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒(HE)；(3)空白對照組：未做任何處理。實時熒光定量RT—PCR分析干擾組、陰性對照組與空白對照組中KCNJ2 mRNA相對表達率，計算出mRNA的沉默效率，western-blot檢測蛋白表達抑制情況。 研究結(jié)果：1．建立了KCN mRNA實時熒光定量檢測方法。KCNJ2和βa

14、ctin的擴增效率為0.99和0.98，組間變異系數(shù)為2.O％和0.8％，組內(nèi)變異系數(shù)為3.2％和3.9％。2．構(gòu)建的質(zhì)粒載體LYS2干擾效果最好，抑制率86％。最有效干擾位點在基因KCNJ2mRNA上+36l～+379堿基。 第四部分RNA干擾對內(nèi)向整流鉀電流(IK1)的影響 研究目的：應用膜片鉗以及壓力鉗技術(shù)在cell—attach方式下，記錄分析質(zhì)粒介導RNA干擾抑制KCNJ2基因表達后內(nèi)向整流鉀電流IK1的變化。

15、 研究方法：選取健康成年wistar大鼠，酶消化機械分離大鼠心室肌細胞，用IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)。大鼠心肌細胞分兩組：實驗組(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒LYS2)、正常組(未作任何處理)。72h后對照組在顯微鏡下選擇心肌細胞用于封接；實驗組在相差顯微鏡下選擇有熒光心肌細胞用于封接。應用膜片鉗以及壓力鉗技術(shù)記錄5個細胞的內(nèi)向整流鋰離子通道的活動，通過pC1amp9.0專用軟件進行記錄，應用QUB單通道活動分析軟件分析單通道數(shù)據(jù)。 研究結(jié)果:1.

16、IKI 鋰離心子通道開放概率(PO),正常組明顯高于實驗組(P<0.05)。2．正常組IK1電流活動明顯高于實驗組。 研究結(jié)論： 1．應用兩次差速貼壁法結(jié)合在培養(yǎng)的前期加入BrdU可以得到高純度 的，具有活力的心肌細胞，滿足實驗需要。 2．成功構(gòu)建5個針對大鼠心肌細胞基因KCNJ2 mRNA的表達特異性 shRNAs真核表達載體。 3．轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞的脂質(zhì)體/質(zhì)粒比為3：1時，培養(yǎng)24h的乳