TPO對(duì)阿霉素作用下心肌細(xì)胞自噬和凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種廣泛應(yīng)用的非常有效的抗腫瘤藥物，其心肌毒性是腫瘤治療中主要關(guān)注的問(wèn)題。心肌細(xì)胞自噬在維持心肌功能中發(fā)揮重要作用，但自噬是把“雙刃劍”，關(guān)于自噬在DOX誘導(dǎo)心肌損傷中的作用以及一些心臟保護(hù)劑到底是通過(guò)促進(jìn)自噬還是抑制自噬發(fā)揮心肌保護(hù)作用還存在爭(zhēng)議。近幾年，促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)被發(fā)現(xiàn)具有心肌保護(hù)作用，有望成為新的心臟保護(hù)藥物，但TPO是否通過(guò)調(diào)控自噬來(lái)保護(hù)心肌細(xì)

2、胞尚未見(jiàn)報(bào)道。最新研究發(fā)現(xiàn)與TPO同源的促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）能夠調(diào)控上皮細(xì)胞的自噬，提出TPO也可能調(diào)控心肌細(xì)胞自噬。因此，本研究旨在(1)研究DOX和（或）TPO對(duì)心肌自噬的影響;(2)研究TPO調(diào)控心肌自噬的分子機(jī)制;(3)研究TPO作用下心肌自噬與凋亡的關(guān)系。
　　將心肌細(xì)胞系H9C2分為Control、DOX、DOX+BFA、DOX+TPO四個(gè)組。以自噬抑制劑巴佛洛霉素A1(bafilom

3、ycinA，BFA)作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。各組細(xì)胞主要作如下檢測(cè):(1)CCK-8染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率;(2)Western-blot和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)自噬和凋亡相關(guān)分子的表達(dá);(3)自噬小體檢測(cè);(4)共聚焦顯微鏡檢測(cè)LC3與LAMP1共定位。
　　研究結(jié)果顯示，DOX處理使H9C2細(xì)胞的存活率明顯下降(p＜0.05)，而加入TPO組相較于單加DOX組，細(xì)胞存活率升高(p＜0.05)。加入DOX后，H9C2細(xì)胞自噬小體數(shù)量明顯增

4、多，而同時(shí)孵育TPO則使自噬小體數(shù)量減少(p＜0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與單DOX處理組相比，TPO使Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)降低，而使p62表達(dá)升高，提示TPO能夠抑制DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬。為了探討TPO對(duì)心肌自噬調(diào)控的機(jī)制，檢測(cè)了GATA-4、ATG14L、Rubicon的表達(dá)以及LC3和LAMP1共定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TPO可以增加H9C2細(xì)胞中GATA-4的表達(dá)。DOX使ATG14L、Rubicon

5、的表達(dá)水平下降。與對(duì)照組相比，DOX可誘導(dǎo)LAMP1的蛋白水平增加，但加入TPO對(duì)LAMP1的蛋白水平無(wú)明顯影響(p＜0.001)。此外，TPO對(duì)LC3和LAMP1的共定位無(wú)影響。最后，研究TPO作用下心肌細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系。與DOX組相比，TPO使H9C2細(xì)胞中caspase-3的mRNA和蛋白水平都有所減少。TPO還可上調(diào)Bcl-2蛋白水平，對(duì)Bcl-2mRNA水平則沒(méi)有明顯的影響(p＜0.05）。
　　綜上所述，TPO能夠