治療性低溫對缺氧期心肌細胞自噬流的影響及機制研究.pdf

1、目的：隨著國民生活方式的改變，我國冠心病的發(fā)病率正逐年攀升并呈年輕化趨勢。為了探討治療性低溫(TH)在缺血期對心肌細胞自噬及自噬流的影響，并探討相關機制。
　　方法：使用大鼠心肌細胞株H9c2，置于含95％氮氣等混合氣體的缺氧盒模擬缺氧，PBS代替完全培養(yǎng)基模擬缺血。
　　第一部分實驗:在不同缺氧時間中，單純?nèi)毖跖cTH處理后的細胞狀態(tài)及活性的差異:實驗分組:1）空白對照組(Control)2)單純?nèi)毖踅M(Hypoxia)3)

2、TH處理缺氧組(TH)，分別置于缺氧盒中模擬缺氧1h、2h、3h，采用光學顯微鏡評估細胞狀態(tài)，臺盼藍拒染實驗判斷活性情況。
　　第二部分實驗:進一步探討TH組與單純?nèi)毖踅M缺氧1-3 h的自噬水平及3h自噬流表達水平的差異:實驗分組:1）空白對照組(Control)2)單純?nèi)毖踅M(Hypoxia)3) TH處理缺氧組(TH)，置于缺氧盒中模擬缺氧1-3 h，免疫印跡法(Western Blot)觀察自噬相關蛋白自噬微管相關蛋白輕鏈3

3、B(LC3B)、p62、Beclin-1，最后用透射電子顯微鏡觀察缺氧3h各組自噬泡形成，腺病毒GFP-mRFP-LC3熒光瞬時轉(zhuǎn)染技術明確自噬流表達水平。
　　通過藥物干預自噬水平，觀察TH在缺氧心肌細胞中的作用，實驗分組:1）單純?nèi)毖踅M(Hypoxia)2)TH處理缺氧組(Hypoxia+TH)3)3甲基腺嘌呤干預單純?nèi)毖踅M（Hypoxia+3-MA）4)3甲基腺嘌呤干預TH處理缺氧組(Hypoxia+ TH+3-MA)5）雷

4、帕霉素干預單純?nèi)毖踅M（Hypoxia+rapamycin）6）雷帕霉素干預TH處理缺氧組(Hypoxia+TH+rapamycin)，3 MA(10 mM)、雷帕霉素(0.1μ M)相關組造模前2h給藥，同時放入缺氧盒中模擬缺氧，免疫印跡法(Western Blot)檢測自噬相關蛋白LC3B，p62的表達情況，臺盼藍拒染實驗檢測細胞活性。
　　第三部分實驗:進一步應用雷帕霉素預處理觀察缺氧期TH影響自噬表達水平中在mTOR信號通路

5、的相關機制，實驗分組:1）單純?nèi)毖踅M(Hypoxia)2)TH處理缺氧組(TH)3)雷帕霉素干預單純?nèi)毖踅M(Hypoxia+rapamycin)4)雷帕霉素干預TH處理缺氧組(TH+rapamycin)，雷帕霉素(0.1μ M)相關組造模前2小時給藥，同時放入缺氧盒中模擬缺氧，免疫印跡法(Western Blot)檢測自噬相關蛋白LC3B、p62，以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路相關蛋白磷酸化mTOR、核糖體蛋白S6(S6

6、)的表達情況。
　　統(tǒng)計學分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間差別統(tǒng)計采用單因素方差分析比較，各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。實驗均獨立重復3次。
　　結(jié)果：1、在不同缺氧時間中，單純?nèi)毖跖cTH處理后細胞狀態(tài)差異:在光學顯微鏡下，隨著缺氧時間的延長，越來越多的細胞發(fā)生皺縮，變圓，與缺氧組相比，TH處理的細胞在缺氧3h

7、細胞形態(tài)明顯改善（圖1-1）;臺盼藍拒染實驗結(jié)果也表明，隨著缺氧時間的延長，細胞活性明顯下降，而TH能有效減少細胞死亡(圖1-2)。
　　2、進一步探討TH組與單純?nèi)毖踅M缺氧3h后自噬活性和自噬流表達水平的差異:缺氧刺激后，免疫印跡法(Western Blot)檢測自噬相關蛋白，顯示隨著缺氧時間延長（缺血1、2、3 h），單純?nèi)毖踅M與對照組相比LC-3B表達顯著增高(p＜0.01)（圖2-1.B），p62表達也相應顯著降低(p＜0

8、.01)（圖2-1.C）;其中缺氧處理2h和3h的時候，而單純?nèi)毖踅M與TH處理組相比LC-3B表達顯著增高（2小時p＜0.05，3小時p＜0.01)，p62表達也相應顯著降低(p＜0.01);但Beclin-1的表達水平在缺氧3h處理后單純?nèi)毖踅M與對照組相比顯著增高(p＜0.01)，但單純?nèi)毖踅M和TH處理組之間并無統(tǒng)計學差異(圖2-1，D)。
　　為了明確在缺氧3h時TH對自噬小體形成以及自噬流的影響，應用透射電子顯微鏡觀察，對照

9、組、單純?nèi)毖踅M、TH組中自噬小體分別是:2.33±1.53（個/HPF），7.00±1.00（個/HPF），3.67±1.15（個/HPF），統(tǒng)計結(jié)果表明單純?nèi)毖踅M明顯高于對照組(p＜0.01)，也明顯高于TH組(p＜0.05)，TH組與對照組無統(tǒng)計學差異（圖2-2）。表明缺氧損傷能大量促進自噬小體形成，TH能部分減少缺氧損傷后的自噬小體。自噬流，即自噬小體的產(chǎn)生與消逝的動態(tài)過程，被認為是更為科學地評價自噬水平的方式，我們進一步探討TH

10、在缺氧下對自噬流調(diào)控情況。我們應用腺病毒GFP-mRFP-LC3瞬時轉(zhuǎn)染細胞，觀察到缺氧3h后，對照組、單純?nèi)毖踅M、TH組中的GFP（點/單個細胞）分別是:4.33±2.52，63.00±9.17，31.00±11.14; mRFP（點/單個細胞）分別是8.33±5.13，139.00±14.11，43.67±18.93。統(tǒng)計結(jié)果表明在GFP和mRFP中單純?nèi)毖踅M均明顯高于對照組和TH組(p＜0.01)，TH組與對照組無統(tǒng)計學差異，即黃

11、點(GFP與mRFP融合的部分)中單純?nèi)毖踅M均明顯高于對照組和TH組(p＜0.01)，TH組與對照組無統(tǒng)計學差異（圖2-3）。上述結(jié)果表明，缺氧能顯著促進自噬流，而TH處理能減少缺氧引起的自噬小體以及自噬溶酶體的形成，從而抑制自噬流。
　　通過藥物干預自噬活性水平，驗證TH在缺氧心肌細胞中的作用及相關機制。
　　3、雷帕霉素預處理觀察缺氧期TH影響自噬表達水平中在mTOR信號通路的相關機制:mTOR被認為是在哺乳動物細胞中負

12、向調(diào)控自噬的關鍵蛋白。核糖體蛋白S6(S6)是mTOR下游的效應蛋白，磷酸化S6被認為是mTOR激活程度重要標記蛋白。因此，我們檢測了各組mTOR和S6的磷酸化程度。缺氧刺激后，應用免疫印跡法檢測自噬相關蛋白，單純?nèi)毖踅M與對照組相比磷酸化mTOR、S6的顯著減少(p＜0.01);而TH處理組與單純?nèi)毖踅M相比磷酸化mTOR和S6蛋白表達顯著增多(p＜0.01)，表明TH處理能部分恢復缺氧后被抑制的mTOR通路相關蛋白中的磷酸化mTOR、S

13、6。雷帕霉素是自噬激動劑，同時也是mTOR蛋白的抑制劑，為了驗證mTOR通路在TH干預缺氧引起的自噬過程中的作用，我們應用雷帕霉素預處理2h，western blot法檢測自噬相關蛋白，雷帕霉素預處理后的兩組與雷帕霉素未處理的兩組（即3組與1組相比;4組與2組相比）相比顯示LC-3B表達增高(p＜0.05)，p62表達也相應顯著降低(p＜0.01)，表明雷帕霉素能有效上調(diào)兩組的自噬活性水平（圖3-1.B，C）;然而，雷帕霉素無法進一步降

14、低單純?nèi)毖鹾螅?組與3組）的磷酸化mTOR和S6蛋白表達水平(p＞0.05)，卻可以抑制TH處理后（2組與4組）的磷酸化mTOR和S6蛋白表達水平(p＜0.05)（圖31.D，E），雷帕霉素處理后的缺氧組與該藥處理后的TH組（3組與4組）相比，磷酸化的mTOR和S6并無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)，表明雷帕霉素處理后能充分抑制mTOR下游信號通路?？偠灾?，雷帕霉素處理后的兩組自噬相關蛋白表達水平明顯升高，表明雷帕霉素能促進缺氧組和TH組

15、的自噬表達水平，且mTOR通路下游相關蛋白表達減少，表明在缺氧期TH能有效激活mTOR通路，且部分通過mTOR通路下調(diào)自噬水平。
　　結(jié)論：1、本研究通過建立誘導H9c2大鼠心肌細胞株缺氧損傷模擬心肌缺血，缺氧3h后可明顯造成H9c2心肌細胞損傷，表明心肌缺氧損傷模型構(gòu)建成功，且TH能有效減輕心肌細胞缺氧損傷，為進一步探討TH對缺氧心肌的自噬水平的影響及相關機制研究提供了研究基礎。
　　2、本研究通過缺氧處理H9c2心肌細胞

16、模擬心肌缺血損傷，TH處理干預細胞損傷，檢測自噬及自噬流水平，表明TH部分抑制缺氧上調(diào)的自噬及自噬流。并進一步應用自噬抑制劑3-甲基腺苷酸、自噬激動劑雷帕霉素預處理后再缺氧處理H9c2心肌細胞模擬的心肌缺血損傷，明確TH在缺氧心肌細胞中的作用:(1)一定水平的自噬對維持細胞活性至關重要;(2)缺氧期間TH保護心肌細胞不僅僅通過對自噬水平的調(diào)節(jié)，還存在其他細胞保護機制。
　　3、本研究通過應用自噬激動劑雷帕霉素預處理后再缺氧處理H9