缺氧心肌細胞微管破壞對線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響及其機制研究.pdf

1、細胞缺氧是嚴重燒傷最常見的病理生理現(xiàn)象之一。嚴重燒傷早期即存在器質(zhì)性心肌損害，即“休克心”。缺血缺氧與炎癥反應失控是“休克心”發(fā)生的主要致病因素。線粒體是心肌細胞缺氧損害的核心靶細胞器，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)的開放引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)，導致線粒體基質(zhì)膨脹、外膜破裂，凋亡信號分子從內(nèi)外膜間釋放，啟動細胞的壞死和凋亡，故mPTP的開放導致線粒體的不可逆損傷是缺氧性心肌細胞損害的關鍵環(huán)節(jié)。 細胞骨架除了對線粒體胞內(nèi)定

2、位及分布起一定作用外，還可能參與線粒體呼吸功能的調(diào)節(jié)過程。在缺氧條件下，心肌細胞骨架較早即發(fā)生變化，同時出現(xiàn)線粒體呼吸功能下降。但缺氧導致的心肌細胞微管破壞是否能導致MPT及其中可能的機制尚不清楚。由于微管的完整性對維持線粒體的結(jié)構(gòu)和功能可能具有重要作用，我們推測，在缺氧條件下，微管變化可能會進一步影響線粒體功能，導致MPT的發(fā)生，這可能是缺氧導致心肌細胞線粒體功能障礙的重要環(huán)節(jié)。本研究旨在驗證上述設想，明確缺氧對離體培養(yǎng)的心肌細胞微管

3、的損傷效應，探討缺氧引起的細胞微管破壞能否導致mPTP開放及微管破壞導致其開放可能的機制。 一、研究目的： 探討缺氧引起的心肌細胞微管破壞能否導致mPTP開放及微管破壞導致其開放可能的機制。 二、材料方法： 1.將分離培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞在94％N2，5％CO2，1％O2的混合氣體中培養(yǎng)，制作缺氧模型。 2.將心肌細胞隨機分為對照組(常氧組、A組)、缺氧組(B組)、常氧+微管解聚劑組(colchic

4、ine，C組)、缺氧+微管穩(wěn)定劑組(taxol，D組)。 3.利用免疫細胞化學染色觀察A組、B組、C組、D組細胞0.5h、1h、3h、6h、12h聚合態(tài)微管形態(tài)，Westernblot法檢測各組心肌細胞聚合態(tài)微管蛋白含量變化。 4.用酯化鈣黃綠素和氯化鈷共孵育的方法檢測mPTP開放，利用四甲基羅丹明乙酯(TMRE)檢測線粒體內(nèi)膜電位，使用免疫印記法檢測胞漿中細胞色素C含量變化，運用MTT法測定細胞活性。 5.以熒

5、光探針Fluo-3/F-127檢測細胞中游離鈣離子濃度，用熒光探針DCFH-DA檢測細胞中活性氧自由基(ROS)水平。 三、主要結(jié)果 1.正常心肌細胞微管圍繞核周呈放射狀排列，微管管狀結(jié)構(gòu)非常清晰。缺氧0.5h后，細胞微管結(jié)構(gòu)即遭受破壞，表現(xiàn)為免疫熒光強度減弱，微管結(jié)構(gòu)的連續(xù)性開始喪失，變得粗糙且不光滑，微管結(jié)構(gòu)不清晰。缺氧1h后微管破壞程度進一步加重，且隨著處理時間的延長，其聚合態(tài)微管蛋白免疫熒光強度和微管蛋白含量與對

6、照組的比值不斷降低，表明隨著處理時間的延長，細胞微管破壞程度不斷加重。 2.用免疫細胞化學方法，通過圖象分析軟件統(tǒng)計分析，量化聚合態(tài)微管免疫熒光強度變化。通過此方法比較4μM、8μM、10μM三種濃度微管解聚劑秋水仙堿(colchicine)和缺氧對心肌細胞微管的破壞效應，初步篩選出8μMcolchicine對心肌細胞微管的破壞效應與缺氧最為接近；Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者微管破壞程度和規(guī)律較為類似。此外，實驗結(jié)果顯示，

7、10μM微管穩(wěn)定劑紫杉醇(taxol)可有效地減輕缺氧對心肌細胞微管的損傷作用。 3.缺氧組和常氧+微管解聚劑組心肌細胞處理0.5h后，即檢測到mPTP明顯開放，線粒體內(nèi)膜電位損耗和細胞活性顯著下降，處理1h后，以上變化程度加重，且隨著處理時間的延長，以上現(xiàn)象愈發(fā)顯著。而同一時相點缺氧+微管穩(wěn)定劑組心肌細胞mPTP開放、線粒體內(nèi)膜電位損耗和細胞活性下降均明顯輕于缺氧組。 4.在常氧組細胞胞漿只能檢測到微量的細胞色素C。缺

8、氧組及常氧+微管解聚劑組處理后0.5h，在細胞胞漿中檢測到的細胞色素C明顯增多，且隨著處理時間的延長，胞漿中的細胞色素C不斷增加；而同一時相點缺氧+微管穩(wěn)定劑組細胞胞漿中檢測到的細胞色素C明顯少于缺氧組。 5.缺氧組和常氧+微管解聚劑組處理0.5h后，心肌細胞中鈣離子濃度及ROS水平較對照組顯著升高。處理1h后，以上變化程度加重，且隨著處理時間的延長，以上現(xiàn)象愈發(fā)顯著。而同一時相點缺氧+微管穩(wěn)定劑組鈣離子濃度及ROS水平升高程度

9、均明顯輕于缺氧組。雖然缺氧組和常氧+微管解聚劑組細胞鈣離子濃度及ROS水平均較對照組顯著升高，但常氧+微管解聚劑組的鈣離子濃度及ROS水平升高程度顯著低于缺氧組。 四、討論與結(jié)論 1.缺氧對心肌細胞聚合態(tài)微管的破壞是細胞缺氧損傷的早期、關鍵事件，且這種損傷隨著缺氧時間的延長不斷加重，具有時間依賴性。8μM微管解聚劑colchicine對心肌細胞微管的破壞作用和同一時相點缺氧對微管的破壞效應類似。但兩組細胞被破壞后的微管結(jié)

10、構(gòu)明顯不同，故兩者導致微管結(jié)構(gòu)破壞的機制很可能是不同的。10μM微管穩(wěn)定劑taxol可以有效地減輕缺氧對心肌細胞微管的損傷作用。 2.缺氧導致微管破壞是引起mPTP開放的重要因素。利用colchicine單純破壞微管可以導致mPTP開放，且taxol能通過減輕微管的缺氧性損害阻止mPTP開放。 3.缺氧心肌細胞微管破壞引起MPT的可能機制是：①鈣超載；②ROS顯著增加；③微管結(jié)構(gòu)破壞引起VDAC通導性變化導致MPT。

11、 4.雖然colchicine與缺氧導致mPTP開放的效應無顯著差別，但缺氧導致的細胞鈣超載和ROS增加程度要明顯大于colchicine。這可能和兩者破壞微管的機制不同有關。其具體機制有待進一步研究。 5.Taxol能通過穩(wěn)定微管阻止mPTP開放，減輕心肌細胞的缺氧性損傷。這為臨床防治“休克心”提供了新的思路和實驗依據(jù)。 VDAC(voltagedependentanionchannel)即電壓依賴性陰離子通道，也