紅景天苷對缺氧心肌細胞的保護作用及其對線粒體ND4蛋白的影響.pdf

1、心肌細胞的能量代謝是心臟活動的物質基礎,線粒體是細胞能量代謝的核心部位，線粒體內膜上存在多種酶與輔酶組成的電子傳遞鏈，電子從 NADH或 FADH2向氧傳遞，形成粒子型氧，再與質子結合生成水，放出的能量則使ADP磷酸化生成 ATP。缺氧可以導致線粒體呼吸鏈功能障礙。呼吸鏈主要涉及復合酶Ⅰ-Ⅳ，復合體Ⅰ包含7種線粒體基因編碼蛋白（包含 ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6和ND4L）。研究發(fā)現(xiàn)ND4蛋白的缺失可使復合體Ⅰ活性完全

2、喪失、復合體Ⅱ活性喪失50％、復合體Ⅳ的活性降至正常的64％。ND4蛋白在線粒體呼吸酶鏈中有重要作用，其活性的改變對線粒體能量代謝有重要影響。本課題主要研究缺氧對心肌細胞線粒體ND4蛋白表達影響及相關機制，并探討中藥單體紅景天苷對其的影響機制。
　　目的：觀察紅景天苷（Salidroside，Sal）對缺氧心肌細胞活性的影響，從心肌細胞線粒體ND4蛋白方面探討紅景天苷對缺氧心肌細胞的保護作用及相關機制。
　　方法：取新生SD

3、乳鼠心臟，通過酶消化法獲得乳鼠心肌細胞，以5×105/mL密度種板，待條件成熟后進行藥物干預實驗。心肌細胞共分為4組：對照組、缺氧模型組、低劑量紅景天苷干預組、高劑量紅景天苷干預組。缺氧模型設計：厭氧產氣盒＋厭氧產氣包＋低糖無血清 DMEM培養(yǎng)基。觀察指標：1.倒置顯微鏡下觀察心肌細胞形態(tài)變化；2.MTT法測定不同培養(yǎng)條件細胞存活率；3.應用分光光度計法測定不同培養(yǎng)條件細胞培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶（LDH）含量；4.應用分光光度計法測定復合物

4、Ⅰ活性變化；5.應用凝膠電泳法測定不同培養(yǎng)條件心肌細胞中脫氧核糖核酸 DNA變化；6.應用蘇木精-伊紅染色法觀察不同培養(yǎng)條件心肌細胞細胞核變化；7.應用Westernblot法測定不同培養(yǎng)條件心肌細胞線粒體 ND4蛋白的表達。
　　結果：（1）倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高劑量紅景天苷干預組細胞凋亡數(shù)量較少（P＞0.05），缺氧模型組中最多（P＜0.01），有統(tǒng)計學意義。（2）MTT法測得缺氧模型組細胞存活率與對照組相比顯

5、著下降（P<0.01），紅景天苷干預組細胞存活率較模型組明顯上升，呈藥物濃度依賴性（P<0.01）；（3）缺氧模型組培養(yǎng)基中LDH含量與對照組相比顯著升高（P<0.01），紅景天苷干預組培養(yǎng)基中LDH水平較缺氧模型組下降，呈藥物濃度依賴性（P<0.01）；（4）缺氧模型組中心肌細胞線粒體復合體Ⅰ的活性與對照組相比明顯降低，紅景天苷干預組也降低，但與單純缺氧模型組相比，酶活性明顯升高（P<0.01）。（5）通過凝膠電泳法發(fā)現(xiàn)，缺氧模型組及

6、低劑量紅景天苷干預組中出現(xiàn)DNA片段（DNA ladder）。對照組及高劑量紅景天苷干預組未見明顯 DNA ladder。（6）HE染色后發(fā)現(xiàn)，缺氧模型組及低劑量紅景天苷干預組中可見大量凋亡細胞（P<0.01），對照組及高劑量紅景天苷干預組未見明顯凋亡細胞。（7） Westernblot法測得，與對照組相比，缺氧模型組線粒體 ND4蛋白含量明顯下降，而紅景天苷干預組下降不顯著（P<0.01）。
　　結論：1.采用厭氧產氣盒＋厭氧產

7、氣包＋低糖DMEM培養(yǎng)基可成功制造缺氧模型；2.缺氧可以損傷心肌細胞，導致細胞培養(yǎng)基中LDH水平升高、細胞存活率下降、線粒體復合體Ⅰ活性降低、細胞DNA損傷、線粒體ND4蛋白表達下降；3.紅景天苷可以減輕缺氧對心肌細胞的損傷，降低細胞培養(yǎng)基中LDH水平，提高細胞存活率，提高線粒體復合體Ⅰ活性，減輕細胞損傷、增強線粒體ND4蛋白表達，這種作用呈濃度依賴性。紅景天苷對心肌細胞的保護作用可能通過增強ND4表達，進一步維持線粒體呼吸鏈的結構與功