紅景天苷對缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其對線粒體ND4蛋白的影響.pdf

1、心肌細(xì)胞的能量代謝是心臟活動的物質(zhì)基礎(chǔ),線粒體是細(xì)胞能量代謝的核心部位，線粒體內(nèi)膜上存在多種酶與輔酶組成的電子傳遞鏈，電子從 NADH或 FADH2向氧傳遞，形成粒子型氧，再與質(zhì)子結(jié)合生成水，放出的能量則使ADP磷酸化生成 ATP。缺氧可以導(dǎo)致線粒體呼吸鏈功能障礙。呼吸鏈主要涉及復(fù)合酶Ⅰ-Ⅳ，復(fù)合體Ⅰ包含7種線粒體基因編碼蛋白（包含 ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6和ND4L）。研究發(fā)現(xiàn)ND4蛋白的缺失可使復(fù)合體Ⅰ活性完全

2、喪失、復(fù)合體Ⅱ活性喪失50％、復(fù)合體Ⅳ的活性降至正常的64％。ND4蛋白在線粒體呼吸酶鏈中有重要作用，其活性的改變對線粒體能量代謝有重要影響。本課題主要研究缺氧對心肌細(xì)胞線粒體ND4蛋白表達(dá)影響及相關(guān)機(jī)制，并探討中藥單體紅景天苷對其的影響機(jī)制。
　　目的：觀察紅景天苷（Salidroside，Sal）對缺氧心肌細(xì)胞活性的影響，從心肌細(xì)胞線粒體ND4蛋白方面探討紅景天苷對缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：取新生SD

3、乳鼠心臟，通過酶消化法獲得乳鼠心肌細(xì)胞，以5×105/mL密度種板，待條件成熟后進(jìn)行藥物干預(yù)實驗。心肌細(xì)胞共分為4組：對照組、缺氧模型組、低劑量紅景天苷干預(yù)組、高劑量紅景天苷干預(yù)組。缺氧模型設(shè)計：厭氧產(chǎn)氣盒＋厭氧產(chǎn)氣包＋低糖無血清 DMEM培養(yǎng)基。觀察指標(biāo)：1.倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)變化；2.MTT法測定不同培養(yǎng)條件細(xì)胞存活率；3.應(yīng)用分光光度計法測定不同培養(yǎng)條件細(xì)胞培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶（LDH）含量；4.應(yīng)用分光光度計法測定復(fù)合物

4、Ⅰ活性變化；5.應(yīng)用凝膠電泳法測定不同培養(yǎng)條件心肌細(xì)胞中脫氧核糖核酸 DNA變化；6.應(yīng)用蘇木精-伊紅染色法觀察不同培養(yǎng)條件心肌細(xì)胞細(xì)胞核變化；7.應(yīng)用Westernblot法測定不同培養(yǎng)條件心肌細(xì)胞線粒體 ND4蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高劑量紅景天苷干預(yù)組細(xì)胞凋亡數(shù)量較少（P＞0.05），缺氧模型組中最多（P＜0.01），有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）MTT法測得缺氧模型組細(xì)胞存活率與對照組相比顯

5、著下降（P<0.01），紅景天苷干預(yù)組細(xì)胞存活率較模型組明顯上升，呈藥物濃度依賴性（P<0.01）；（3）缺氧模型組培養(yǎng)基中LDH含量與對照組相比顯著升高（P<0.01），紅景天苷干預(yù)組培養(yǎng)基中LDH水平較缺氧模型組下降，呈藥物濃度依賴性（P<0.01）；（4）缺氧模型組中心肌細(xì)胞線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性與對照組相比明顯降低，紅景天苷干預(yù)組也降低，但與單純?nèi)毖跄Ｐ徒M相比，酶活性明顯升高（P<0.01）。（5）通過凝膠電泳法發(fā)現(xiàn)，缺氧模型組及

6、低劑量紅景天苷干預(yù)組中出現(xiàn)DNA片段（DNA ladder）。對照組及高劑量紅景天苷干預(yù)組未見明顯 DNA ladder。（6）HE染色后發(fā)現(xiàn)，缺氧模型組及低劑量紅景天苷干預(yù)組中可見大量凋亡細(xì)胞（P<0.01），對照組及高劑量紅景天苷干預(yù)組未見明顯凋亡細(xì)胞。（7） Westernblot法測得，與對照組相比，缺氧模型組線粒體 ND4蛋白含量明顯下降，而紅景天苷干預(yù)組下降不顯著（P<0.01）。
　　結(jié)論：1.采用厭氧產(chǎn)氣盒＋厭氧產(chǎn)

7、氣包＋低糖DMEM培養(yǎng)基可成功制造缺氧模型；2.缺氧可以損傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平升高、細(xì)胞存活率下降、線粒體復(fù)合體Ⅰ活性降低、細(xì)胞DNA損傷、線粒體ND4蛋白表達(dá)下降；3.紅景天苷可以減輕缺氧對心肌細(xì)胞的損傷，降低細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平，提高細(xì)胞存活率，提高線粒體復(fù)合體Ⅰ活性，減輕細(xì)胞損傷、增強(qiáng)線粒體ND4蛋白表達(dá)，這種作用呈濃度依賴性。紅景天苷對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可能通過增強(qiáng)ND4表達(dá)，進(jìn)一步維持線粒體呼吸鏈的結(jié)構(gòu)與功