心肌細(xì)胞缺氧和紅景天苷干預(yù)的差異性表達(dá)蛋白的SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析及線粒體相關(guān)的機(jī)制研究.pdf

1、目的:心肌細(xì)胞缺氧過程中始終伴隨著可能誘導(dǎo)細(xì)胞損傷（壞死、凋亡等）的能量代謝變化，這些變化在心血管疾病進(jìn)程方面起著至關(guān)重要的作用。紅景天苷(Salidroside，SAL)是紅景天的有效成分之一，近年來有研究表明SAL具有抗心肌缺氧、保護(hù)心臟功能等作用。本研究旨在通過氯化鈷(CoCl2)體外刺激H9c2大鼠心肌細(xì)胞制備化學(xué)缺氧模型，應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析缺氧組和SAL干預(yù)組心肌細(xì)胞蛋白表達(dá)差異，分析線粒體三羧酸循環(huán)相關(guān)酶和凋亡相關(guān)的

2、線粒體信號(hào)途徑分子的表達(dá)變化，探討SAL對(duì)缺氧心肌的保護(hù)作用機(jī)制。
　　方法:以H9c2大鼠心肌細(xì)胞為靶細(xì)胞，使用不同劑量CoCl2刺激H9c2細(xì)胞，篩選適宜的CoCl2刺激濃度，對(duì)照組加入等量的DMEM高糖培養(yǎng)基;使用不同濃度SAL預(yù)處理H9c2細(xì)胞不同時(shí)間，再以適宜的CoCl2濃度刺激細(xì)胞，篩選最佳的SAL保護(hù)濃度，對(duì)照組加入等量的DMEM高糖培養(yǎng)基。采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記細(xì)胞(SILAC)結(jié)合質(zhì)譜的方法篩選缺氧組、紅景天苷預(yù)處理

3、組和對(duì)照組的差異表達(dá)蛋白，運(yùn)用The Databasefor Annotation，Visualization andIntegrated Discovery(DAVID)生物信息學(xué)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。Hochest33342染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡比例;熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化;化學(xué)發(fā)光分析法檢測細(xì)胞內(nèi)ATP濃度變化;Western Blot檢測琥珀酰輔酶A連接酶1(SUCLG1)、琥珀酰輔酶A連接酶2(S

4、UCLG2)、蘋果酸脫氫酶2(MDH2)、Cleaved-caspase-3、caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。。
　　結(jié)果:
　　1 CoCl2對(duì)H9c2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為500μmol/L:根據(jù)文獻(xiàn)以CoCl2500μmol/L為中心，雙向擴(kuò)大刺激濃度范圍為300，400，500，600和700μmol/L。分別刺激H9c2細(xì)胞24 h，對(duì)照組加入等量的DMEM培養(yǎng)基。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):CoCl2300

5、，400，500，600和700μmol/L組細(xì)胞存活率明顯受到抑制，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），細(xì)胞活性隨CoCl2濃度增加呈現(xiàn)遞減趨勢，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CoCl2對(duì)H9c2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為500μmol/L，故選取500μmol/L為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中CoCl2的刺激濃度。
　　2常氧狀態(tài)下SAL對(duì)H9c2細(xì)胞無明顯增殖作用:根據(jù)文獻(xiàn)以SAL(1，10，100，1000 nmol/L)分別作用于H9c2細(xì)胞12，24，

6、36 h，對(duì)照組加入等量的DMEM培養(yǎng)基。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)SAL濃度為1000 nmol/L作用于H9c2細(xì)胞12，24，36 h時(shí)，細(xì)胞存活率下降，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05); SAL濃度為1，10，100 nmol/L作用于H9c2細(xì)胞12，24，36 h時(shí)，細(xì)胞存活率無明顯變化，與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，常氧條件下，SAL對(duì)H9c2細(xì)胞無明顯增殖作用，故選取24 h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中SAL的作用時(shí)間。

7、>　　3低氧狀態(tài)下SAL使H9c2細(xì)胞活力升高:以不同濃度SAL(1，10，100，1000 nmol/L)預(yù)處理細(xì)胞24 h，隨后細(xì)胞暴露于500μmol/L CoCl2的低氧環(huán)境下持續(xù)培養(yǎng)24 h，對(duì)照組加入等量的DMEM培養(yǎng)基。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):1，10，100，10000 nmol/L SAL均能抑制CoCl2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞毒性作用，并且SAL濃度為100 nmol/L時(shí)效果最明顯(P＜0.05)，故選取SAL100 nm

8、ol/L為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中SAL的預(yù)處理濃度。
　　4蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的定量比較分析:在穩(wěn)定同位素正反標(biāo)記的四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，共發(fā)現(xiàn)5088個(gè)蛋白(protein level FDR＜1％)，其中838個(gè)同時(shí)存在于四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺氧組與正常組相比，共鑒定到30個(gè)上調(diào)蛋白和62個(gè)下調(diào)蛋白;SAL預(yù)處理組與缺氧組相比，共鑒定到70個(gè)上調(diào)蛋白和36個(gè)下調(diào)蛋白。
　　5基因功能分析:將鑒定有意義的上調(diào)和下調(diào)蛋白進(jìn)行DAVI

9、D生物學(xué)進(jìn)程和細(xì)胞組分分析，結(jié)果均表明SAL保護(hù)缺氧H9c2細(xì)胞的作用機(jī)制主要集中于細(xì)胞糖代謝如乙酰輔酶A代謝、三羧酸循環(huán)(TCA cycle)、氧化呼吸等生理過程，其中SAL對(duì)三羧酸循環(huán)酶SUCLG1，SUCLG2，MDH1和MDH2的調(diào)控作用尤為突出。
　　6 SAL能降低低氧環(huán)境誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡:倒置顯微鏡下觀察H9c2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)正常貼壁的H9c2細(xì)胞形態(tài)為梭形，但經(jīng)過CoCl2誘導(dǎo)的缺氧刺激后，細(xì)胞變成鵝卵

10、石樣甚至圓形，細(xì)胞皺縮，部分從培養(yǎng)皿底部脫落;同時(shí)，這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化在SAL抗缺氧組的細(xì)胞中表現(xiàn)不明顯。Hoechst33342實(shí)驗(yàn)檢測H9c2細(xì)胞核水平發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞暴露于500μmol/L CoCl224 h后，與正常組相比，出現(xiàn)細(xì)胞核皺縮、染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成等變化，但這些變化在經(jīng)SAL100 nmol/L預(yù)處理24 h的抗缺氧組細(xì)胞中不明顯。FITC-annexinⅤ和PI雙染的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺氧組的細(xì)胞凋亡率顯著增加，而

11、SAL100 nmol/L預(yù)處理24 h組能明顯逆轉(zhuǎn)此趨勢。
　　7 SAL能有效提升細(xì)胞線粒體膜電位（ΔΨm）
　　8 SAL能維持細(xì)胞內(nèi)外鈣穩(wěn)態(tài):缺氧組細(xì)胞較正常組細(xì)胞有明顯的鈣超載趨勢，同時(shí)紅景天抗缺氧組細(xì)胞的鈣離子熒光信號(hào)強(qiáng)度較缺氧組明顯削弱（P＜0.05）。
　　9 SAL能有效抑制ROS形成
　　10 SAL能顯著抑制CoCl2誘導(dǎo)的ATP大量消耗（P＜0.05）。
　　11 SAL具有調(diào)節(jié)三羧

12、酸循環(huán)的功能:SAL100 nmol/L預(yù)處理H9c2細(xì)胞24 h，繼而持續(xù)暴露于500μmol/L CoCl224 h，各組內(nèi)參β-actin的表達(dá)一致; SUCLG1，SUCLG2表達(dá)量均較對(duì)照組顯著降低;MDH2表達(dá)量較對(duì)照組上調(diào);SAL預(yù)處理組能逆轉(zhuǎn)此趨勢(P＜0.05)。
　　12 SAL能有效抑制線粒體凋亡途徑:與對(duì)照組相比，缺氧組caspase9和活化caspase3蛋白表達(dá)水平急劇上升;與缺氧組相比，SAL預(yù)處理組

13、caspase9和活化caspase3蛋白表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)。
　　13 SAL能有效調(diào)節(jié)Bcl-2家族相關(guān)蛋白表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡:與正常組相比，缺氧能顯著下調(diào)Bcl-2（抑制凋亡）蛋白表達(dá)量，并上調(diào)Bax（促進(jìn)凋亡）蛋白表達(dá)量;與缺氧組相比，SAL預(yù)處理24 h組能明顯逆轉(zhuǎn)上述Bcl-2和Bax表達(dá)變化趨勢(P＜0.05)。
　　結(jié)論:SAL通過調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)相關(guān)的催化酶、增高線粒體膜電位水平、抑制ROS生