老年大鼠心肌線粒體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究及差異蛋白的功能分析.pdf

1、近年來(lái)，關(guān)于衰老方面的研究已成為全世界范圍的熱點(diǎn)問(wèn)題。線粒體功能和衰老的發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。首先，線粒體產(chǎn)生自由基，又是氧化損傷的靶標(biāo)，衰老的心肌產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加，可導(dǎo)致線粒體膜電位喪失和心肌凋亡；其次，衰老的心臟、骨骼肌、肝臟組織中存在線粒體DNA缺失和突變。線粒體DNA損傷能誘導(dǎo)呼吸鏈復(fù)合體的多肽改變，電子傳遞下降，ROS產(chǎn)生進(jìn)一步增加；再次，衰老的心臟線粒體的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性受損

2、。比較蛋白質(zhì)組學(xué)作為多基因、多因素復(fù)雜病理機(jī)制研究的有效手段，可高通量、大規(guī)模地篩檢在疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子，運(yùn)用該研究策略，可獲得一些傳統(tǒng)手段無(wú)法得到的新蛋白標(biāo)志物，新關(guān)鍵分子，極大地豐富了診斷標(biāo)志物的選擇組合及復(fù)雜致病機(jī)理的全面闡明。目前關(guān)于老年大鼠心肌線粒體的蛋白質(zhì)組學(xué)及差異蛋白功能分析的研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)新生期，成年期，老年期三個(gè)不同發(fā)育階段SD大鼠心肌線粒體的全蛋白質(zhì)組表達(dá)譜進(jìn)行差異分析，篩出了

3、一些差異蛋白質(zhì)，并對(duì)其中的差異分子乙醛脫氫酶2(Aldehydedehvdmgenase 2，ALDH2)，用Western Blot，RT-PCR，基因轉(zhuǎn)染等細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行了功能分析和驗(yàn)證。同時(shí)，對(duì)ALDH2基因多態(tài)性與長(zhǎng)壽的相關(guān)性進(jìn)行了研究。 第一部分 不同發(fā)育階段SD大鼠心肌線粒體的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析 目的：建立并優(yōu)化心肌線粒體蛋白質(zhì)組研究的雙向凝膠電泳(two-dimensional gel elect

4、rophoresis，2-DE)技術(shù)平臺(tái)；篩查心肌線粒體中與衰老相關(guān)的蛋白質(zhì)。 方法：將清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為新生(2天)、成年(10周)、老年(12月)三組，提取心肌線粒體，抽提線粒體全蛋白質(zhì)行2-DE，對(duì)樣品制備、上樣量、電泳參數(shù)、不同固定方式、不同染色方法、不同裂解液等相關(guān)技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assistedlaser desorption ionization time

5、-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)鑒定圖像分析出的差異蛋白點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行了心肌組織ATP含量的檢測(cè)。 結(jié)果：45％乙醇5％乙酸的固定液對(duì)蛋白質(zhì)固定效果最好；膠體考染和快速銀染都是較理想的染色方法；含9M尿素的裂解液抽提蛋白，2-DE圖譜所得蛋白點(diǎn)最多；構(gòu)建了心肌線粒體具有高度分辨率和高度重復(fù)性的2-DE圖譜。圖像分析示2-DE凝膠有1100個(gè)蛋白點(diǎn)，84個(gè)心肌線粒體蛋白表達(dá)發(fā)生改變

6、，質(zhì)譜鑒定了43個(gè)差異點(diǎn)。差異蛋白多和呼吸鏈功能，能量代謝，物質(zhì)運(yùn)輸和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。新生期心肌組織ATP含量最低(15.49±1.33．g ATP/g 心肌)，老年期心肌組織ATP含量較成年期下降(41.48±2.99 vs 59.64±2.68．gATP/g 心肌，p<0.01)。能量代謝的生化檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果。 結(jié)論：建立了SD大鼠心肌線粒體蛋白質(zhì)組的2-DE分析技術(shù)。通過(guò)具有高度分辨率和高度重復(fù)性的2-DE

7、圖譜鑒定了SD大鼠心肌線粒體中在老年期差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，這些差異蛋白為深入理解衰老的分子機(jī)制提供了有益的線索。 第二部分 差異蛋白乙醛脫氫酶2的再驗(yàn)證及其對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞衰老進(jìn)程的影響 目的：為保證差異蛋白初篩結(jié)果的可信及下游分析的確定性，首先對(duì)差異蛋白ALDH2進(jìn)行再驗(yàn)證，并探討ALDH2在人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(MRC-5)衰老進(jìn)程中的作用。 方法：應(yīng)用Western blot，RT-PCR檢測(cè)不同發(fā)育階段

8、心肌線粒體中ALDH2在蛋白、mRNA水平的表達(dá)情況。通過(guò)構(gòu)建腺病毒載體，使用含有ALDH2基因的腺病毒液將ALDH2基因?qū)隡RC-5細(xì)胞中，并獲得表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)衰老相關(guān)的．－半乳糖苷酶染色(senescence-associated－．－galactosidae staining，SA－．－gal staining)、細(xì)胞內(nèi)ROS水平和細(xì)胞周期觀察其對(duì)MRC-5細(xì)胞衰老的影響。 結(jié)果：Western blot，RT-PCR證

9、實(shí)ALDH2的確在老年大鼠心肌線粒體中低表達(dá)。與對(duì)照組細(xì)胞相比，ALDH2基因?qū)牒?，MRC-5細(xì)胞的SA－．－gal染色陽(yáng)性率下降，ROS水平較對(duì)照組下降(p<0.01)。細(xì)胞周期未見(jiàn)明顯改變。 結(jié)論：ALDH2能延緩MRC-5細(xì)胞衰老的進(jìn)程。 第三部分 ALDH2基因多態(tài)性與長(zhǎng)壽的相關(guān)性研究 目的：分析ALDH2在長(zhǎng)壽人群中的基因型分布頻率，進(jìn)而探索ALDH2基因多態(tài)性和長(zhǎng)壽的關(guān)系。 方法：在山東省章

10、丘市采集397名長(zhǎng)壽老人和有非長(zhǎng)壽家族史的161名60—75歲的對(duì)照組老人進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查研究，并應(yīng)用變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)技術(shù)檢測(cè)研究對(duì)象的ALDH2基因型。 結(jié)果：長(zhǎng)壽組ALDH2<'*>1/ALDH2<'*>1、ALDH2<'*>1/ALDH2<'*>2 和 ALDH2<'*>2/ALDH2<'*>2三種基因型頻率分

11、別為65.7％，32.7％，1.5％。長(zhǎng)壽組ALDH2<'*>1和ALDH2<'*>2等位基因的頻率分別為82.12％和17.88％。長(zhǎng)壽組基因型和等位基因的頻率與對(duì)照組比較，均有顯著性差異(p=0．001)。 結(jié)論：ALDH2基因多態(tài)性與長(zhǎng)壽現(xiàn)象有關(guān)聯(lián)。 結(jié)論： 1．建立了穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)，適合自己實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)的2-DE技術(shù)平臺(tái)。通過(guò)對(duì)2-DE相關(guān)技術(shù)的摸索和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)(1)膠體考染法和快速銀染法均為較理想的染色

12、方法；(2)45％乙醇5％乙酸的固定液對(duì)蛋白質(zhì)固定效果最好，建議用于2-DE染色顯示；(3)不同裂解液對(duì)最終蛋白斑點(diǎn)數(shù)影響較大。含9M尿素的裂解液處理線粒體獲得蛋白斑點(diǎn)數(shù)最多。 2．通過(guò)對(duì)不同發(fā)育階段心肌線粒體的全蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行比較，鑒定出43種差異顯著蛋白，推測(cè)衰老與線粒體內(nèi)多種差異蛋白相關(guān)。其中部分差異蛋白如ALDH2在老年期表達(dá)下降為最新報(bào)道。 3．ALDH2基因的腺病毒液轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，SA－