野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠右室心肌細(xì)胞自噬及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓（Pulmonary artery hypertension，PAH）是一種進(jìn)行性的肺血管與心臟結(jié)構(gòu)功能異常的病理生理綜合征。盡管肺血管損害是PAH原發(fā)病變，然而患者的臨床預(yù)后主要取決于右心室的功能狀態(tài)。目前，臨床上PAH的藥物主要為抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增殖與肺血管收縮，此類藥物能降低肺動(dòng)脈壓、緩解PAH患者的癥狀與改善生活質(zhì)量，但并不能有效逆轉(zhuǎn)患者右心室功能狀態(tài)與臨床預(yù)后。臨床上對(duì)右心室重構(gòu)機(jī)制及藥物治療的認(rèn)識(shí)均源于左心室。

2、遺憾的是，PAH右心室重構(gòu)可能存在與壓力負(fù)荷左心室并不完全相同的機(jī)制，因此大部分治療左心衰的藥物對(duì)右心衰并無效果。深入研究PAH右室重構(gòu)的細(xì)胞和分子機(jī)制為PAH治療藥物篩選，開發(fā)右室特異性藥物、逆轉(zhuǎn)右室重構(gòu)，從而改善患者預(yù)后具有重要的科學(xué)意義及臨床價(jià)值。
　　自噬是一種酵母至哺乳動(dòng)物進(jìn)化過程中形成的，通過細(xì)胞內(nèi)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體包裹細(xì)胞成份，并與溶酶體相溶合、從而形成自噬溶酶體，籍此降解與再循環(huán)長壽命蛋白與細(xì)胞器的生命活動(dòng)過程。目

3、前證實(shí)，自噬與細(xì)胞存亡調(diào)控存在密切關(guān)系，參與了多種結(jié)構(gòu)性心臟病心臟重構(gòu)。右室心肌缺血、缺氧是PAH右室重構(gòu)重要的病理生理基礎(chǔ)。磷酸腺苷活化的蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)與缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，Hif1

4、-α）/腺病毒E1B19 kDa蛋白相互作用蛋白3(Adenovirus E1B19-kDa interacting protein3,BNIP3)/Beclin-1是缺氧條件下細(xì)胞自噬激活的兩條重要信號(hào)通路。但PAH右室重構(gòu)過程中右室心肌細(xì)胞自噬時(shí)序性變化？以上兩條信號(hào)通路是否參與PAH右室心肌自噬調(diào)控？不同信號(hào)通路激活自噬對(duì)心肌細(xì)胞的作用如何？尚未闡明。本課題在建立野百合堿(Monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)PAH大鼠模型及缺

5、氧培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，通過以下三部分的實(shí)驗(yàn)，初步探討PAH右心室重構(gòu)發(fā)展過程中心肌自噬變化規(guī)律、可能調(diào)控機(jī)制及其生物學(xué)作用。該研究結(jié)果將為PAH治療藥物篩選，開發(fā)右室特異性自噬調(diào)控藥物、防治PAH右室重構(gòu)與功能異常提供初步理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第一部分野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型建立及右室心肌缺氧相關(guān)指標(biāo)變化。
　　目的:建立野百合堿誘導(dǎo)PAH大鼠模型，觀察PAH大鼠右室結(jié)構(gòu)、功能變化;并探討PAH大鼠右室心

6、肌細(xì)胞缺氧相關(guān)指標(biāo)變化。
　　方法:60只8周齡雄性Sprague Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為MCT組(n=36)及對(duì)照組(n=24)。兩組動(dòng)物均設(shè)2、4、6周3個(gè)時(shí)點(diǎn)亞組;MCT組每個(gè)時(shí)點(diǎn)亞組12只，對(duì)照組每個(gè)時(shí)點(diǎn)亞組8只。采用經(jīng)項(xiàng)背部皮下注射MCT（60mg/kg）建立肺動(dòng)脈高壓模型（MCT組），對(duì)照組（CON組）注射等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)對(duì)存活大鼠行超聲心動(dòng)圖檢查，測量右室結(jié)構(gòu)與功能參數(shù);右心導(dǎo)管檢測肺動(dòng)脈收縮壓(Pu

7、lmonary artery systolic pressure,PASP)、肺動(dòng)脈平均壓（Pulmonary artery mean pressure，PAMP）;測量右室肥厚指數(shù);蘇木精—伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色了解肺血管及右室心肌組織病理改變，測量肺血管阻塞率，心肌細(xì)胞直徑，Masson染色檢測心肌膠原含量。麥胚凝集素染色(Wheat germ agglutininstaining

8、，WGA)檢測右室心肌細(xì)胞面積大小;CD31免疫熒光染色檢測心肌毛細(xì)血管生成;用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitativepolymerase chain reaction，RT-qPCR)、免疫組化與蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測心肌肌紅蛋白(myoglobin)的mRNA與蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:與對(duì)照組相比，MCT大鼠PASP、PAMP均顯著增高，以6周組為著。MCT大鼠2周時(shí)右室心肌輕

9、度肥厚、右室收縮功能維持正常;4周右室擴(kuò)大，心室明顯肥厚、收縮功能輕度減低;6周時(shí)右室顯著擴(kuò)大重構(gòu)、心功能顯著降低并出現(xiàn)右心衰癥狀。組織病理學(xué)上，MCT大鼠肺動(dòng)脈血管阻塞率較對(duì)照組增高并持續(xù)增加;2周始右室心肌細(xì)胞直徑及面積輕度增大，4周與6周最為顯著。MCT大鼠2周亞組右室心肌膠原含量與對(duì)照組無顯著差異，而4與6周亞組MCT顯著增多。與對(duì)照組相比，MCT大鼠的2周亞組心肌毛細(xì)血管數(shù)目、myoglobin的mRNA及蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義，而4周與6周亞組則顯著降低。
　　結(jié)論:MCT成功構(gòu)建PAH大鼠模型，復(fù)制PAH右室重構(gòu)的發(fā)展過程。MCT大鼠2周出現(xiàn)右室心肌細(xì)胞肥大;而4周及6周時(shí)心肌細(xì)胞持續(xù)增大、毛細(xì)血管減少與心肌myoglobin水平降低誘導(dǎo)右室心肌缺血、缺氧是PAH右室重構(gòu)的重要病理生理基礎(chǔ)。
　　第二部分肺動(dòng)脈高壓大鼠右室心肌細(xì)胞自噬變化及可能的調(diào)控通路
　　目的:探討PAH大鼠右室重構(gòu)過程中，右室心肌細(xì)胞自噬時(shí)序性變化規(guī)律及其與肺動(dòng)

11、脈收縮壓的關(guān)系;闡明缺氧相關(guān)自噬信號(hào)通路在PAH大鼠右室心肌自噬的調(diào)控作用。
　　方法:動(dòng)物造模與分組同第一部分。RT-qPCR檢測右室與左室心肌自噬標(biāo)志蛋白-微管相關(guān)輕鏈蛋白3(Microtubule associated light chain protein3，LC3) mRNA水平;免疫組化及Western blot檢測LC3蛋白表達(dá);western blot檢測自噬體降解標(biāo)志蛋白P62表達(dá);透射電鏡觀察右室心肌細(xì)胞自噬體

12、形態(tài)與數(shù)目。Western blot檢測右室心肌AMPK/mTOR及Hif-1α/BNIP3/Beclin-1缺氧通路的關(guān)鍵蛋白p-AMPK，AMPK，p-mTOR，mTOR，p-p70S6K，p70S6K以及Hif-1α，BNIP3，Beclin-1，Bcl2的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與對(duì)照組相比，MCT大鼠右室心肌LC3，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及于2，4，6周持續(xù)上調(diào)表達(dá)，而P62則下調(diào)表達(dá);透射電鏡顯示右室心肌細(xì)胞內(nèi)自噬體

13、持續(xù)增多;相反，對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)亞組LC3，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比及P62差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，心肌細(xì)胞內(nèi)自噬體少見。此外，MCT及對(duì)照組大鼠的各時(shí)點(diǎn)亞組左室心肌LC3，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及P62差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。右室心肌LC3蛋白水平與增高的肺動(dòng)脈收縮壓呈顯著正相關(guān)（r2=0.626，P＜0.01）。與對(duì)照組相比，p-AMPK蛋白于2周至4周上調(diào)表達(dá)，而在6周時(shí)下調(diào)表達(dá);相反，p-mTOR則表現(xiàn)為2周至4周下調(diào)，而在6周時(shí)上調(diào)表達(dá);各

14、時(shí)點(diǎn)AMPK，mTOR及p70S6K蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，與對(duì)照組相比，BNIP3、Beclin-1蛋白于2周至4周呈較低水平表達(dá)，而6周時(shí)顯著上調(diào)，Hif-1α與BNIP3變化趨勢不完全一致，于4周達(dá)峰值，6周稍下降。此外，MCT大鼠右室心肌Bcl2于2周時(shí)達(dá)到峰值，4周至6周依次降低。對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)亞組右室心肌相關(guān)蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:PAH右室心肌持續(xù)激活自噬與增高的肺動(dòng)脈收縮壓呈顯著正相關(guān)關(guān)系。A

15、MPK/mTOR及BNIP3/Beclin-1缺氧相關(guān)自噬信號(hào)通路可能參與了PAH右室自噬調(diào)控;2周至4周自噬激活主要通過AMPK/mTOR通路，而6周時(shí)則主要為BNIP3/Beclin-1通路依賴，BNIP3的活化不完全受Hif-1α所調(diào)控。
　　第三部分 AMPK/mTOR及BNIP3/Beclin-1通路調(diào)控自噬對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的影響
　　目的:通過研究AMPK/mTOR和BNIP3/Beclin-1調(diào)控自噬對(duì)缺氧心肌細(xì)

16、胞影響;結(jié)合第二部分研究，進(jìn)一步揭示不同通路激活自噬對(duì)PAH右室重構(gòu)的作用。
　　方法:(1)將一組大鼠心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞分為常氧組、缺氧組(2天)、缺氧+AMPK抑制劑(Compound C)組、缺氧+AMPK激活劑(AICAR)組共四亞組;western blot檢測心肌細(xì)胞p-AMPK，AMPK，p-mTOR，mTOR通路關(guān)鍵蛋白表達(dá);單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin，MDC)熒光染色觀察心肌自噬體，

17、western blot檢測LC3蛋白表達(dá)水平;在bafilomycin A1處理缺氧及缺氧+AICAR心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上，再次通過MDC熒光染色觀察自噬體，western blot檢測LC3蛋白表達(dá)水平;WGA熒光染色顯示心肌細(xì)胞大小，RT-qPCR檢測心房鈉尿肽(Atrial natriuretic peptide，AYP)與B型腦鈉肽(Type B natriuretic peptide，BNP)的mRNA表達(dá);CCK8法檢測心肌細(xì)

18、胞存活率;流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡。將另一組心肌細(xì)胞分為缺氧組、缺氧+AICAR組、缺氧+AICAR+3-MA組;MDC熒光染色觀察心肌自噬小體，Western blot檢測LC3蛋白表達(dá)水平;CCK8法檢測心肌細(xì)胞存活率;流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡。
　　(2)將一組心肌細(xì)胞分為常氧組、缺氧組（4天）、陰性對(duì)照組，缺氧+BNIP3-RNAi干擾組，缺氧+LV-BNIP3過表達(dá)共五亞組;Western blot檢測心肌細(xì)胞BNI

19、P3及Beclin-1通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平;MDC熒光染色檢測心肌細(xì)胞自噬小體，Western blot檢測LC3蛋白表達(dá)水平;CCK8法檢測心肌細(xì)胞存活率;流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡。在baiilomycin A1處理缺氧及缺氧+LV-BNIP3過表達(dá)心肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上，再次通過MDC熒光染色觀察自噬體，western blot檢測LC3蛋白表達(dá)水平。將另一組心肌細(xì)胞分為缺氧組、缺氧+陰性對(duì)照組、缺氧+LV-BNIP3過表達(dá)組、缺氧+B

20、NIP3過表達(dá)+3-MA組;MDC熒光染色觀察心肌自噬小體，Western blot檢測LC3蛋白表達(dá)水平;CCK8法檢測心肌細(xì)胞存活率;流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:
　　(1)與常氧組相比，缺氧組p-AMPK/AMPK上調(diào)表達(dá)，而p-mTOR/mTOR下調(diào)表達(dá);MDC熒光強(qiáng)度增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上調(diào)表達(dá);心肌細(xì)胞存活率下降，而凋亡率增高。與缺氧組相比，Compound C干預(yù)組p-AMPK/AMPK

21、下調(diào)表達(dá)，而p-mTOR/mTOR上調(diào)表達(dá);MDC熒光強(qiáng)度降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下調(diào)表達(dá);心肌細(xì)胞存活率降低;凋亡率顯著增高。相反，AICAR干預(yù)組p-AMPK/AMPK上調(diào)表達(dá)，而p-mTOR/mTOR下調(diào);MDC熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高;心肌細(xì)胞存活率增高;凋亡率顯著降低。各組心肌細(xì)胞大小及ANP、BNP mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)bafilomycin A1處理后，缺氧及缺氧+AICAR干預(yù)

22、組心肌細(xì)胞 MDC熒光強(qiáng)度及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著增加。與缺氧+AICAR組相比，缺氧+AICAR+3-MA組心肌細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下調(diào)表達(dá);心肌細(xì)胞存活率降低;凋亡率顯著增高。
　　(2)與常氧組相比，缺氧組BNIP3及Beclin-1上調(diào)表達(dá);MDC熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上調(diào)表達(dá)，心肌細(xì)胞存活率下降，凋亡率增加。與缺氧組相比，BNIP3-RNAi干擾組的BNIP3及Becl

23、in-1下調(diào)表達(dá)，MDC熒光強(qiáng)度減低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下調(diào)表達(dá);心肌細(xì)胞存活率增加，凋亡率降低;相反，LV-BNIP3過表達(dá)組BNIP3及Beclin-1上調(diào)表達(dá)，MDC熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上調(diào)表達(dá);心肌細(xì)胞存活率降低，凋亡率增高。陰性對(duì)照組與缺氧培養(yǎng)組各檢測指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)bafilomycin A1處理后，缺氧及缺氧+LV-BNIP3過表達(dá)組心肌細(xì)胞MDC熒光強(qiáng)度及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ顯著增加