泛素連接酶RNF2與MANF的相互作用及其神經保護作用.pdf

1、中腦星形膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(mesencephalicastrocyte-derivedneurotrophicfactor,MANF)是一種分泌性蛋白,在內質網應激(Endoplasmicreticulumstress,ERstress)情況下可上調表達,對缺血的心、腦具有保護作用,并對體外培養(yǎng)的原代神經細胞具有保護作用,且具有抑制炎癥的作用,但MANF的具體作用機制仍不明確。我們通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人胚胎腦cDNA文庫,尋找

2、與MANF相互作用蛋白,為進一步研究MANF的功能機制奠定基礎。通過酵母雙雜交篩選出7個與MANF相互作用的蛋白,RNF2蛋白是其中之一。RNF2是Polycombgroup(PcG)家族的成員,過表達同屬PcG家族的SCMH1或BMI1蛋白可減輕缺血耐受大鼠的神經損傷,并且RNF2在缺血耐受大鼠腦和視網膜中表達上調,據此我們推測RNF2可能也具有神經保護作用。本研究通過體內和體外實驗驗證MANF和RNF2的相互作用,在大鼠腦缺血再灌注

3、的模型中觀察RNF2和MANF在缺血皮層中的表達及共定位情況,并觀察過表達或沉默RNF2對體外誘導ER應激的神經細胞損傷的影響,以證實RNF2與MANF的相互作用及其神經保護作用。
　　目的:
　　1、篩選與MANF相互作用的蛋白;
　　2、驗證RNF2與MANF的相互作用;
　　3、觀察RNF2的神經保護作用。
　　方法:
　　用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與MANF相互作用的蛋白,結果篩選出7個與MANF相

4、互作用的蛋白,RNF2就是其中之一。再分別用酵母共轉、體外Pulldown、免疫共沉淀、細胞免疫熒光、核漿分離等方法驗證RNF2和MANF的相互作用;線栓法制作SD大鼠腦缺血再灌注(MCAO)模型,采用免疫熒光雙標方法檢測RNF2和MANF在MCAO模型大鼠腦組織皮質部位的表達和定位情況;用tunicamycin(TM)處理N2A細胞,誘導ER應激,過表達或沉默RNF2后,用免疫印跡法檢測CHOP和激活的caspase-3的表達水平,并

5、用PI染色觀察細胞死亡情況。
　　結果:
　　1.用酵母雙雜交方法篩選與MANF相互作用的蛋白
　　1.1誘餌質粒pGBKT7-MANF的毒性及自激活效應檢測
　　構建酵母雙雜交誘餌質粒pGBKT7-MANF,分別將空載體pGBKT7和誘餌質粒pGBKT7-MANF小規(guī)模轉化酵母Gold菌,待長出較密克隆后,分別挑取直徑相同的GoldpGBKT7和GoldpGBKT7-MANF,在3ml的YPDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過

6、夜后,600nm的吸光度分別為1.25和1.24,表明誘餌質粒pGBKT7-MANF對酵母沒有毒性,不影響酵母的正常生長。GoldpGBKT7-MANF在SD/-His/-Trp營養(yǎng)缺陷板上不生長,在SD/-Trp/X-α-gal平板上長出白色菌落,說明pGBKT7-MANF沒有自身報告基因激活的能力。
　　1.2檢測bait陽性酵母克隆中MANF融合蛋白的表達
　　為了進一步確定酵母轉化的陽性克隆中確實表達MANF的融合蛋

7、白,我們用IB的方法檢測了酵母裂解液中的MANF蛋白。結果顯示:轉化空載體pGBKT7的酵母表達分子量約25KD的載體蛋白。與對照相比,轉化pGBKT7-MANF的酵母蛋白樣品中所檢測到的融合蛋白分子量約為45kd,與預期相符。說明pGBKT7-MANF在酵母中可以表達。
　　1.3酵母融合與陽性克隆的篩選
　　將轉化了誘餌質粒的酵母與轉化了人胚胎腦文庫的酵母菌株共同孵育結合,在倒置顯微鏡下觀察到大量三葉草狀二倍體細胞時終止

8、孵育。然后將菌液涂布于60塊TDO平板上篩選出180個陽性克隆。挑取直徑大的克隆,點在QDO/X平板上,篩選出17個變藍的克隆。從QDO/X平板上挑取深藍色克隆,反復3次劃線于DDO/X平板上,去掉2個假陽性克隆,再將DDO/X平板上篩選所得的所有純藍色陽性克隆反復3次劃線于QDO/X平板上,得到15個純藍色的陽性克隆。
　　1.4基因序列的測定與分析
　　將篩選出的15個陽性酵母克隆做菌落PCR,排除掉PCR產物大小一致的

9、克隆。提取陽性克隆質粒電轉化大腸桿菌后提取質粒,進一步經核苷酸序列測定,并與GenBank數據庫進行同源性比較,發(fā)現7個與人MANF相互作用的蛋白,RNF2蛋白為其中之一。
　　2.酵母回復性雜交驗證RNF2和MANF的相互作用
　　將RNF2全長編碼序列構建到pGADT7載體上,將pGBKT7-MANF和pGADT7-RNF2共轉化到酵母Gold菌株進行回復性雜交。結果顯示:共轉化后的酵母可以在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基QDO/X上正

10、常生長并呈現藍色,提示在酵母中RNF2確實能與MANF相互作用。
　　3.GSTpull-down證明RNF2和MANF有直接的相互作用
　　為進一步明確在酵母體系中篩選出的RNF2和MANF相互作用,我們表達并純化GST-RNF2蛋白和MANF-his蛋白。將純化的兩種蛋白混合后進行GSTpull-down實驗。結果表明,RNF2能與MANF特異性的結合,證明RNF2和MANF有直接的相互作用。
　　4.免疫共沉淀證

11、實MANF與RNF2相互作用
　　為了進一步研究MANF與RNF2是否在真核細胞內相互作用,我們建立了穩(wěn)定轉染GFP-MANF的細胞系N2A-MANF,用RNF2抗體沉淀穩(wěn)定轉染細胞系N2A-MANF中的RNF2蛋白,再用GFP抗體檢測免疫沉淀物中是否含有MANF。結果表明,在真核細胞內RNF2可以與MANF相互作用。
　　5.ER應激誘導神經細胞中的MANF入核,與RNF2相互作用
　　5.1ER應激誘導神經細胞中的

12、MANF與RNF2共定位于細胞核
　　本課題組前期的研究發(fā)現,ER應激可以誘導神經細胞中MANF的核轉運。本研究中我們想了解是否MANF與RNF2在神經細胞核內可以相互作用。我們用tunicamycin(4μg/ml)刺激N2A細胞,16hrs后收集細胞做免疫熒光染色,觀察MANF和RNF2的共定位情況。結果顯示,未經tunicamycin刺激的N2A中,RNF2蛋白為細胞核定位的蛋白,而MANF蛋白主要分布于胞漿。經tunica

13、mycin刺激后,MANF在細胞核內的含量明顯增多,并與RNF2共定位。
　　5.2免疫共沉淀證實MANF與RNF2在細胞核內相互作用
　　在N2A細胞中轉染MANF-FLAG質粒,用tunicamycin(4μg/ml)刺激N2A細胞,16hrs后收集細胞分離細胞核和細胞漿蛋白,用FLAG抗體分別沉淀胞漿和胞核的MANF蛋白,IB檢測免疫沉淀物中是否含有RNF2。結果表明,RNF2和MANF在細胞核內相互作用,且在ER應激

14、下相互作用明顯增強。
　　6.ER應激誘導神經細胞中RNF2的表達
　　為了觀察ER應激狀態(tài)下RNF2的表達情況,我們在N2A中給予ER應激誘導劑tunicamycin(4μg/ml)處理16hrs,IB檢測結果發(fā)現MANF和RNF2的表達都顯著上調。說明ER應激同樣能誘導神經細胞中RNF2的表達。
　　7.輕度腦缺血再灌注損傷誘導神經細胞中的RNF2表達及其與MANF的共定位
　　為了觀察RNF2在大鼠腦缺血再

15、灌注損傷的大腦皮層中的表達情況和與MANF的共定位情況,我們用線栓法制作SD大鼠腦缺血再灌注模型,用免疫熒光雙標方法觀察MANF和RNF2的表達和定位情況。結果發(fā)現:在缺血再灌注24hrs的大腦皮層中,RNF2和MANF的表達均上調,且共定位。而在缺血再灌注48hrs后,皮層水腫嚴重,RNF2和MANF幾乎不表達,提示輕度腦缺血再灌注損傷可以誘導神經細胞中RNF2和MANF的表達。
　　8.RNF2knockdown并驗證

16、　　應用RNAi技術對N2A細胞中內源性的RNF2進行敲低。轉染RNF2-siRNA后分別于24hrs,48hrs,36hrs和72hrs收取細胞,提取蛋白檢測RNF2蛋白質水平的變化。結果顯示:轉染36hrs~48hrsRNF2的沉默效率最高。
　　9.RNF2可以減少ER應激介導的神經細胞的死亡
　　在N2A細胞中瞬時轉染RNF2的過表達質?；騭iRNA,經TM處理16hrs或不經TM處理后進行PI染色,并對染色陽性細胞

17、進行計數分析。結果發(fā)現在TM處理的實驗組中,過表達RNF2能減少PI染色陽性的細胞數,沉默內源性的RNF2能明顯增加PI染色陽性的細胞數,提示RNF2可以抑制ER應激介導的細胞死亡。
　　10.RNF2通過抑制caspases-3的活化減少ER應激介導的神經細胞的凋亡
　　我們在N2A細胞中瞬時轉染RNF2的過表達質粒或siRNA,經TM處理16hrs或不經TM處理,IB檢測結果發(fā)現TM處理后CHOP和激活的caspase-