H5N1與人蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建及PB2與RNF31相互作用研究.pdf

1、H5N1與人蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建及與人蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建及PB2與RNF31相互作用研究相互作用研究TheConstructionofH5N1VirusHostInteractionwkStudyontheInteractionBetweenPB2RNF31學科專業(yè)：制藥工程研究生：陳潔指導教師：楊曉明教授天津大學化工學院二零一四年六月摘要甲型H5N1高致病性禽流感出現(xiàn)的人畜共患現(xiàn)象已引起社會恐慌。H5N1病毒侵染機體，與宿主蛋白

2、相互作用以完成病毒復制和轉(zhuǎn)錄，為了確定宿主蛋白在H5N1病毒致病過程中發(fā)揮的作用，本實驗室前期通過酵母雙雜交技術(shù)，以病毒蛋白為誘餌，對人脾文庫進行篩選，篩選出與H5N1禽流感病毒的10個病毒蛋白相互作用的179個宿主蛋白。本研究通過生物信息學方法構(gòu)建了病毒蛋白與人蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)這些相互作用多集中在病毒聚合酶復合體，參與調(diào)解包括細胞凋亡、免疫應答、蛋白轉(zhuǎn)運、RNA加工等多個生物學過程；與隨機網(wǎng)絡蛋白相比發(fā)現(xiàn)，H5N1相互作用的蛋

3、白在網(wǎng)絡中的連接度和介度均高于其他蛋白，且更傾向于連接在一起；同時對宿主蛋白和宿主蛋白鄰近蛋白進行基因富集分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要集中在NFκB、WNT、MAPK、p53及凋亡通路；此外還將H5N1與其他禽流感毒株以及其他病原體的人相互作用蛋白質(zhì)進行基因功能分析，為更好的解釋不同流感毒株或不同病原體侵染宿主產(chǎn)生不同機體反應提供思路?；谙嗷プ饔镁W(wǎng)絡分析，我們選擇病毒聚合酶PB2與人RNF31這對相互作用進行深入研究。PB2是流感病毒聚合酶

4、的一個重要亞基，它與病毒毒力相關并決定病毒的宿主范圍，PB2多個氨基酸殘基的改變都可以引起宿主范圍的改變；RNF31是E3泛素連接酶的一種，其對NFκB轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，RNF31下調(diào)時抑制對TNFα介導的NFκB轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)NFκB下游與炎癥相關因子表達，抑制TNFα介導的IκBα的磷酸化，同時細胞凋亡增多。另外本研究通過間接免疫熒光、核質(zhì)分離發(fā)現(xiàn)PB2與RNF31共定位于胞核，通過CoIP證實PB2與RNF3

5、1相互作用發(fā)生在胞核內(nèi)，相互作用結(jié)構(gòu)域分別位于PB2N端1471肽段和RNF31C端9101062肽段。同時，PB2抑制NFκB轉(zhuǎn)錄活性和NFκB下游與凋亡相關的靶基因表達；干涉RNF31，PB2對NFκB轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用消失；流式細胞分析發(fā)現(xiàn)PB2促進細胞凋亡，與下調(diào)RNF31促凋亡結(jié)果相一致，提示PB2是通過RNF31影響NFκB轉(zhuǎn)錄活性和其介導的生物學功能。此外，穩(wěn)定性實驗和胞核CoIP發(fā)現(xiàn)，RNF31不僅能微弱影響PB2的穩(wěn)定