中期因子相互作用蛋白質(zhì)研究.pdf

1、中期因子(midkine，MK)是一個由121個氨基酸組成的分子量約為1.kDa的堿性蛋白質(zhì)，屬于肝素結(jié)合生長因子家族，其在人胚胎的肝、腎和腦部組織中高表達，但在健康成人體內(nèi)表達量卻很低，然而在腫瘤患者體內(nèi)表達量又會顯著地升高。研究發(fā)現(xiàn)MK在很多方面顯示與腫瘤發(fā)生有關(guān)的活性，包括促細胞增殖、轉(zhuǎn)化、血纖蛋白溶解、血管新生和抗細胞調(diào)亡等，但對其發(fā)揮一系列生物學(xué)功能的機理卻并不明了?；诘鞍踪|(zhì)相互作用在生命活動的重要性，本碩士學(xué)位論文利用酵母

2、雙雜交技術(shù)篩選MK的相互作用蛋白質(zhì)，為深入研究MK參與的分子途徑、闡明其發(fā)揮功能的分子機理打下基礎(chǔ)。
　　 我們首先將MK全長基因克隆至Invitrogen公司ProQuest酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌載體pDBLeu中，構(gòu)建成功的pDBLeu-MK轉(zhuǎn)化酵母細胞MaV203，對該雙雜交系統(tǒng)的兩個報告基因lacZ和URA3分別進行檢驗后確定MK無自身轉(zhuǎn)錄激活能力。在此基礎(chǔ)上，通過小規(guī)模篩庫，確定在大規(guī)模篩庫中使用2.mM的3AT濃度以及

3、1.μgcDNA文庫量較為合適。在大規(guī)模篩庫后，我們從2×106數(shù)量的轉(zhuǎn)化子中篩選得到51個可能的陽性克隆。經(jīng)過X-gal方法的檢驗，確定其中30個克隆呈陽性。抽提得到酵母陽性克隆的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用氨芐青霉素篩選獲得文庫質(zhì)粒，測序并將結(jié)果在GenBank中進行BLAST序列比對，共得到6個不同的蛋白質(zhì)。最后將篩選獲得的文庫質(zhì)粒分別與pDBLeu和pDBLeu-MK共轉(zhuǎn)化酵母進行自身活性鑒定及活性再鑒定，并最終確定5個候選蛋

4、白，它們分別為Dvl-bindin.protei.nake.cuticle2(NKD2)、磷脂混雜酶1(phospholipi.scramblas.1,PLSCR1)、顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)和潛活TGF-β結(jié)合蛋白3，4(laten.transformin.growt.factorbet.bindin.protei.3an.4，LTBP-3.-4)。
　　 由于酵母雙雜交技術(shù)本身的缺陷，所得到的相互作用

5、蛋白質(zhì)還需通過pulldown、FRET、co-IP等方法進行進一步驗證。因此在本論文的第二部分，我們采用了i.vitropulldown的方法來初步驗證篩選獲得的相互作用的真實性。首先我們將各個蛋白的全長基因克隆到體外表達載體pCMVTnT中，然后在Promega公司的TNT快速轉(zhuǎn)錄/翻譯耦聯(lián)系統(tǒng)中分別表達35[S]-甲硫氨酸標記的蛋白。將表達產(chǎn)物分別與原核表達純化的His-MK共孵育，利用特異性結(jié)合His標簽的鎳珠將孵育后的復(fù)合物沉

6、淀下來，并通過SDS-PAGE分離復(fù)合物，最后放射自顯影檢測35[S]-甲硫氨酸標記的蛋白是否被His-MK共沉淀下來，從而確定它們是否與MK發(fā)生相互作用。目前為止，我們利用此方法驗證了NKD2、PLSCR1、PGRN與MK能在體外發(fā)生直接的相互作用。
　　 在本研究中所篩選到的MK相互作用蛋白質(zhì)有細胞外基質(zhì)組分，也有胞內(nèi)重要的信號分子，暗示中期因子可能參與的生物學(xué)過程的多樣性以及它在其中發(fā)揮作用的機制的復(fù)雜性。研究結(jié)果不僅為闡