基于核酸內(nèi)切酶及RNA連接酶的循環(huán)放大檢測(cè)DNA及腫瘤細(xì)胞.pdf

1、針對(duì)惡性腫瘤等疾病早期檢測(cè)方法靈敏度與準(zhǔn)確性尚需提高的問題.研究基于核酸內(nèi)切酶及RNA連接酶的循環(huán)放大反應(yīng)，用于DNA片段和腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。利用核酸內(nèi)切酶對(duì)特定位點(diǎn)的限制性內(nèi)切原理及RNA連接酶的交叉催化自我復(fù)制性質(zhì)，設(shè)計(jì)常溫循環(huán)放大反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，從而提高檢測(cè)靈敏度。將核酸內(nèi)切酶及RNA連接酶參與的循環(huán)放大與DNA和腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)相結(jié)合，提高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)降低了檢測(cè)限，實(shí)現(xiàn)較低含量DNA片段及腫瘤細(xì)胞的高靈敏檢測(cè)，為重大疾病

2、的早期診斷提供檢測(cè)手段。本論文共分為五章：
　　第一章，概述了DNA的組成與分類、核酸內(nèi)切酶的簡(jiǎn)介及作用并簡(jiǎn)單介紹了DNA邏輯門，化學(xué)發(fā)光分析與熒光化學(xué)分析等方法。對(duì)RNA連接酶的交叉復(fù)制與循環(huán)放大做了說明，對(duì)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)及前景做了介紹。
　　第二章，利用DNA能與其互補(bǔ)鏈雜交或者能特異性的與靶分子結(jié)合的特性，構(gòu)建了多輸入“AND”邏輯門，同時(shí)檢測(cè)三種靶DNA片段。該邏輯門由G1/G2與11、12、13雜交形成，其中G1自

3、身兩端分別雜交形成頸-環(huán)結(jié)構(gòu)，中間部分與G2的兩端互補(bǔ)使G2也形成凸起結(jié)構(gòu)。當(dāng)待測(cè)的11、12、13存在時(shí)，分別與其互補(bǔ)的環(huán)狀單鏈DNA(ssDNA)雜交，引發(fā)循環(huán)反應(yīng)。對(duì)于在包金的納米磁微粒表面修飾相應(yīng)的DNA鏈P1，通過輸入11、12、13片段，將三環(huán)發(fā)卡狀的G1/G2打開，使G1與金納米磁珠上的發(fā)卡狀DNA鏈P1互補(bǔ)，通過限制性剪切酶的作用，將互補(bǔ)的DNA部分剪斷，形成兩段hemin的適體，通過hemin與適體的特異性結(jié)合，催化l

4、uminol和H2O2化學(xué)發(fā)光，得到檢測(cè)信號(hào)。檢測(cè)三種DNA的線性范圍為1.0×10-12M至5.0×10-11M，檢測(cè)限為1.2×10-12M。
　　第三章，通過DNA的堿基A與T，G與C互補(bǔ)原理，構(gòu)建DNA“OR”邏輯門，并進(jìn)一步利用核酸內(nèi)切酶對(duì)特定位點(diǎn)的限制性內(nèi)切原理，將核酸內(nèi)切酶參與的循環(huán)放大與DNA邏輯門相結(jié)合，提高DNA邏輯門的靈敏度。作為輸入條件的三段DNA片段11、12、13。當(dāng)有任意一條DNA存在并且濃度均高于1

5、.0×10-12M的條件下，通過DNA互補(bǔ)作用，產(chǎn)生dsDNA片段。而每一個(gè)互補(bǔ)的片段中設(shè)計(jì)了特定的限制酶剪切位點(diǎn)，在限制酶的存在下將會(huì)剪切成更小的片段，通過設(shè)計(jì)的模板與DNA聚合酶的作用，產(chǎn)生出便于檢測(cè)的特定DNA序列3，3與帶有熒光基團(tuán)修飾的DNA鏈互補(bǔ)，通過剪切與磁分離，做熒光檢測(cè)，而此過程在DNA內(nèi)切酶與聚合酶等的作用下會(huì)不斷循環(huán)，得出對(duì)于輸入條件DNA的濃度在1.0×10-12M至5.0×10-11M范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，其

6、檢測(cè)限為2.0×10-12M。
　　第四章，研究了RNA連接酶參與的交叉循環(huán)信號(hào)放大對(duì)于腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。利用表面修飾了羧基的磁微粒作為DNA的載體，與一端修飾了氨基的Ramos細(xì)胞適體S1形成化學(xué)鍵，將DNA鏈S1修飾到磁珠表面，并且通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原理使S1與S2雜交成雙鏈。當(dāng)加入不同個(gè)數(shù)的Ramos細(xì)胞時(shí)，由于細(xì)胞的取代作用，在上清液里分離出不同條數(shù)的S2鏈。當(dāng)有S2存在時(shí)，能與兩條RNA鏈E1、E2形成雜交體，該雜交體具有R