利用植物體內(nèi)引導(dǎo)RNA偶聯(lián)核酸內(nèi)切酶進行基因組編輯的研究.pdf

1、近年來發(fā)展起來的靶向基因組編輯技術(shù)是一種能夠針對特定DNA序列進行定點突變的方法。其主要方法是對目的基因進行改造，進而達到對未知功能基因研究的目的。精確的基因組編輯是一個為闡明基因功能和基因治療的功能強大工具。最近的DNA編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶(ZNF)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)它們都是通過設(shè)計核酸酶與特異性識別結(jié)合DNA序列的蛋白融合而成，已經(jīng)在細胞系或者生物體中成功造成基因組的改變。ZNF和TALEN的方法都要求需要

2、兩套相反方向的與DNA重復(fù)結(jié)合的識別蛋白，其組裝過程非常繁瑣和耗費大量時間。近期，一項由RNA介導(dǎo)的規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)技術(shù)已經(jīng)成功運用于特定基因組的改變，其系統(tǒng)是在天然細菌II型適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的。與ZNF和TALEN相比，CRISPR/Cas系統(tǒng)的DNA識別系統(tǒng)簡單，是通過短的指導(dǎo) RNA來識別目的基因序列并與其互補。在CRISPR/ Cas系統(tǒng)中實現(xiàn)基因組編輯，其選擇目標(biāo)序列的選擇受限制于以G開始轉(zhuǎn)錄的U

3、6啟動子，預(yù)留的20bp識別序列終止于Cas9核酸內(nèi)切酶的識別和切割位點NGG。此外,最近的研究表明這個系統(tǒng),以及ZFN和TALEN,都可能產(chǎn)生不良的脫靶效應(yīng)?？偟膩碚f，一種新的基因組編輯技術(shù)方法要求能夠人為可簡單的設(shè)計，對目的基因序列的選擇具有高度的靈活性并且能夠?qū)μ禺愋晕稽c進行突變。GRATEN系統(tǒng)包含一條既能夠識別特異性序列又能夠被噬菌體外殼蛋白識別的嵌合 RNA，以及噬菌體外殼蛋白核酸內(nèi)切酶組成的融合蛋白構(gòu)成。我們在植物中利用引

4、導(dǎo)RNA偶聯(lián)核酸內(nèi)切酶(guided RNA and tethered endonuclease, GRATEN)用于基因組編輯，探究該套系統(tǒng)在植物基因組特異DNA序列位點達到突變的可行性。實驗對象為本式煙草葉，通過滲透注射煙草葉片，農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物瞬時表達，進行了致使突變的探究。這些核糖核蛋白復(fù)合物有效地在本式煙草中破壞靶基因，其特點是能夠簡單的設(shè)計，對目標(biāo)序列的選擇沒有要求并且只對特異性位點進行突變。探討利用該系統(tǒng)進行DNA精確突變的

5、可能性，通過研究，建立一種簡單、精確和高效的新型植物基因組編輯技術(shù)體系。
　　在本課題中我們做到一次性克隆多個基因，在“DNA洗牌技術(shù)”的幫助下，組裝了多個表達載體節(jié)省了大量時間和工作量。本實驗構(gòu)建了以 GFP蛋白作為標(biāo)簽的定位表達載體，以此來研究克隆基因所表達蛋白在細胞中的位置，分別在GFP的N和C端預(yù)留克隆位點，以克隆目的基因，完成構(gòu)建二種 GFP標(biāo)簽蛋白質(zhì)表達載體。利用該基因克隆載體，將內(nèi)切酶 FokI的切割結(jié)構(gòu)域與 MS2

6、噬菌體外殼蛋白 MCP的串聯(lián)蛋白（FokI:MCP:FokI, FMF）分別克隆至GFP的N和C端，得到FMF與GFP的融合蛋白GFP:FMF和FMF:GFP，其中FMF的N端帶有細胞核定位信號。以本式氏煙草和洋蔥表皮為植物材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染植物瞬時表達，通過激光共聚焦顯微鏡觀察侵染的煙草細胞， GFP在細胞中單獨表達，并在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布,而帶有核定位的FMF:GFP和 GFP:FMF二種融合蛋白只在細胞核中觀察到熒光。