利用基因組編輯技術(shù)研究非編碼RNA的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件.pdf

1、目的：
　　本研究針對(duì)XIST的敲低建立了在HEK293T細(xì)胞中的CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)，以及利用該系統(tǒng)揭示非編碼基因miRNA-146a新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1.本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和TALEN技術(shù)在HEK293T細(xì)胞中對(duì)已知的XIST的核心啟動(dòng)子進(jìn)行編輯,建立了通過(guò)酶切、測(cè)序等鑒定突變效率的方法,并且結(jié)合極限稀釋法、片段分析和TA克隆測(cè)序得到基因型確定的XIST低表達(dá)的單

2、克隆細(xì)胞系。
　　2.利用CRISPR/Cas9技術(shù)突變miRNA-146a多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，鑒定調(diào)控miRNA-146a轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵區(qū)域。
　　3.使用熒光定量PCR、熒光素酶報(bào)告基因、DNA甲基化分析和染色質(zhì)免疫沉淀等技術(shù)揭示miRNA-146a轉(zhuǎn)錄調(diào)控的新機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立優(yōu)化后的針對(duì)HEK293T細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng)；CRISPR/Cas9和TALEN對(duì)XI

3、ST核心啟動(dòng)子的突變可以有效地抑制XIST的表達(dá)。
　　2.位于miRNA-146a初級(jí)轉(zhuǎn)錄本內(nèi)含子區(qū)的單堿基chr5:159912213(GRCh37/hg19)的缺失導(dǎo)致顯著的miRNA-146a的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。
　　3.單堿基chr5:159912213(GRCh37/hg19)的缺失可導(dǎo)致整個(gè)miRNA-146a宿主基因的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的增加和RNA聚合酶II結(jié)合的增加。
　　結(jié)論：
　　1.針對(duì)XIST核心