基因組編輯新技術(shù)對(duì)豬CCR5基因的靶向作用.pdf

1、動(dòng)物基因組編輯技術(shù)是指研究人員能夠依照特定的目的去修飾動(dòng)物的遺傳組成，這是一項(xiàng)綜合性的并且富有挑戰(zhàn)性的技術(shù)。該技術(shù)由于能夠比較容易并且精確的對(duì)基因組進(jìn)行DNA的添加、刪除和置換的操作，使得其在改良畜產(chǎn)品質(zhì)量，提高生產(chǎn)性能，研究疾病模型，研發(fā)生物醫(yī)藥產(chǎn)品等方面都顯示出廣闊的應(yīng)用前景?；蚨c(diǎn)敲入時(shí)，需要為一些外源基因，如報(bào)告基因、自殺基因、篩選基因、治療性基因和外源性優(yōu)良性狀基因提供一個(gè)安全可靠的停泊“港口”，在這些“港口”外源基因既可穩(wěn)

2、定高效表達(dá)，又對(duì)細(xì)胞和組織無(wú)已知的副作用。近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生物安全性一直是人們討論的熱點(diǎn)問(wèn)題。從目前已經(jīng)已發(fā)表的文獻(xiàn)看來(lái)，針對(duì)豬基因組安全港位點(diǎn)的研究鳳毛麟角。因此，尋找合適的安全港位點(diǎn)對(duì)于轉(zhuǎn)基因豬的制備顯得尤為重要。
　　在克隆動(dòng)物的制備中，耳成纖維細(xì)胞作為供核體細(xì)胞具有取材簡(jiǎn)便，成本低，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)影響小等優(yōu)點(diǎn)，并且從耳部組織的采樣能夠?qū)崿F(xiàn)活體取樣，從而為優(yōu)良豬種的保種育種奠定基礎(chǔ)。本研究第一部分采用組織塊培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)并

3、建立豬耳成纖維細(xì)胞系，然后用電轉(zhuǎn)染的方法將質(zhì)粒pEGFP-C1導(dǎo)入該細(xì)胞系，探索并優(yōu)化其最適條件和參數(shù)。最后成功建立上海白豬耳成纖維細(xì)胞系。電轉(zhuǎn)后經(jīng)過(guò)對(duì)各組轉(zhuǎn)染效果的觀察，發(fā)現(xiàn)在DNA量為20ng，電壓為150 V，電阻為500Ω，電容為500μF的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)，并且電轉(zhuǎn)后經(jīng)37℃孵育，其效果最好。
　　第二部分為了研究CCR5基因作為安全港基因的可能性，首先分析了CCR5基因序列，發(fā)現(xiàn)該基因位于豬基因組第13號(hào)染色體上，基因總

4、長(zhǎng)4565bp，CDS區(qū)位于第二外顯子上。然后針對(duì)CDS區(qū)atg下游約110bp處分別設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建了TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)的打靶載體，并將其分別電轉(zhuǎn)染豬耳成纖維細(xì)胞。然后用CruiseTM酶對(duì)細(xì)胞池進(jìn)行酶切驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)TALEN打靶CCR5基因CDS區(qū)的結(jié)果為陰性，CRISPR的pool驗(yàn)證顯示敲除效率很低。初步懷疑這兩種技術(shù)在該位點(diǎn)上進(jìn)行打靶可能存在的脫靶效應(yīng)。
　　第三部分為檢測(cè)分析上海梅山豬封閉群攜帶豬內(nèi)源

5、性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)存在與表達(dá)的情況，為該豬種作為器官移植供體的生物安全性提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)，筆者從上海嘉定區(qū)梅山豬育種中心的梅山豬封閉群內(nèi)隨機(jī)采集45頭豬的耳組織，并構(gòu)建耳成纖維細(xì)胞系，利用PCR檢測(cè)PERV前病毒核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)以及囊膜基因(env)的基因組DNA，利用RT-PCR的方法檢測(cè)mRNA表達(dá)狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)被檢測(cè)的45份樣品均攜帶完整的3