大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型CCR5基因干擾治療的研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一個(gè)累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)性炎癥性的自身免疫疾病，其病理為慢性滑膜炎，侵及下層的軟骨和骨，造成關(guān)節(jié)破壞，RA的病因至今不明，目前也尚無特效治療手段。T、B淋巴細(xì)胞，尤其是CD4+T淋巴細(xì)胞引發(fā)的滑膜巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的過度激活和增殖是RA病變形成的最重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。在RA的病變滑膜，可以看到大量T淋巴細(xì)胞圍繞新生血管分布及由T、B淋巴細(xì)胞組成的類似淋巴結(jié)的結(jié)構(gòu)。這種病理性淋巴細(xì)胞的聚集是病變關(guān)節(jié)滑膜炎形成的關(guān)鍵

2、因素，而在這種炎性細(xì)胞的定向趨化和聚集過程中，趨化因子受體及其配體發(fā)揮著極其重要的作用。
　　趨化因子(Chemokine)是一類含70～90個(gè)氨基酸殘基的分泌型細(xì)胞因子。根據(jù)其分子內(nèi)特定半胱氨酸的數(shù)量及位置可分為CXC、CC、C、CX3C四個(gè)亞族，趨化因子具有激活各類白細(xì)胞，促進(jìn)其游走聚集，引起炎癥反應(yīng)的功能，趨化因子受體5(CCR5)是CC亞族趨化因子MIP-1a（巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1 a）、MIP-1β和RANTES（正常T

3、細(xì)胞活化后表達(dá)和分泌的調(diào)節(jié)蛋白）的特異性受體。在已知的趨化因子受體中，CCR5及其配體RANTES及MIP-1在RA的病理形成過程中具有重要意義。在人類RA患者及RA模型鼠的滑膜組織，CCR5的表達(dá)均較正常對(duì)照顯著增強(qiáng)，且其配體的表達(dá)也明顯提高。相關(guān)研究說明CCR5及其配體作用經(jīng)路在RA滑膜炎性細(xì)胞趨化和浸潤過程中扮演重要角色，尋找一種真正可以用于臨床的抑制CCR5表達(dá)的方法是一項(xiàng)非常有意義的工作。
　　RNA干擾技術(shù)（RNA i

4、nterfering，RNAi）是利用生物進(jìn)化過程中保存下來的一種mRNA表達(dá)抑制機(jī)制，人工引入互補(bǔ)的小干擾RNA，最終實(shí)現(xiàn)目的基因表達(dá)抑制-即基因沉默(gene silencing)的技術(shù)。該技術(shù)具有效率高，靶向性強(qiáng)等特點(diǎn)。目前，RNAi技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于基因功能鑒定、惡性腫瘤、病毒性肝炎及艾滋病治療等多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。作為HIV病毒感染人CD4+巨噬細(xì)胞的必須協(xié)同受體，利用RNAi技術(shù)抑制CCR5表達(dá)的工作在艾滋病領(lǐng)域得到了深入研究，

5、并顯示了很好的臨床應(yīng)用前景。而在RA領(lǐng)域，目前尚無應(yīng)用RNAi抑制CCR5表達(dá)的研究，我們將通過體外研究構(gòu)建大鼠CCR5 mRNA的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，并通過293T工具細(xì)胞篩選出特異性質(zhì)粒，采用大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型，通過在體電穿孔的方法進(jìn)行RNA干擾，抑制其CCR5 mRNA的表達(dá)，以明確該方法的有效性和安全性，從而為RA的治療探尋一種有效的新的治療方法。
　　方法:
　　1、根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)并構(gòu)建大鼠CCR5 siR

6、NA表達(dá)質(zhì)粒及CCR5過表達(dá)質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，應(yīng)用Westemblot檢測rCCR5蛋白表達(dá)水平， real time PCR檢測rCCR5 mRNA表達(dá)水平，篩選出特異性CCR5 siRNA表達(dá)質(zhì)粒。
　　2、建立AIA大鼠模型，電穿孔法進(jìn)行動(dòng)物在體的CCR5 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染位置及效果。臨床觀察大鼠一般情況、關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)及關(guān)節(jié)滑膜病理評(píng)分，Western Blot及rea

7、l time PCR分析CCR5蛋白及mRNA表達(dá)的情況，評(píng)估CCR5基因治療效果。
　　結(jié)果:
　　1、各組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，在倒置熒光顯微鏡下見到細(xì)胞內(nèi)發(fā)出均勻明亮的綠色熒光。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，熒光顯微鏡下觀察，表達(dá)EGFP的陽性細(xì)胞百分比，67±3.2％。
　　2、293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染后36小時(shí)檢測CCR5蛋白及mRNA表達(dá)水平，D1質(zhì)粒相比其它3組質(zhì)粒及NC質(zhì)粒對(duì)CCR5的干擾抑制作用最強(qiáng)，(P＜0.01)

8、，為有效篩選靶點(diǎn)。
　　3、動(dòng)態(tài)觀察Wistar大鼠轉(zhuǎn)染后1～5天，轉(zhuǎn)染后1天可以看到EGFP蛋白的表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度隨著時(shí)間逐漸增高，3天時(shí)達(dá)高峰，之后EGFP的表達(dá)隨時(shí)間的延長而逐漸減低，而在對(duì)側(cè)未干擾關(guān)節(jié)未發(fā)現(xiàn)熒光的表達(dá)。
　　4、Wistar大鼠FCA免疫后7天起出現(xiàn)部分大鼠關(guān)節(jié)紅腫，第14～18天FCA組大鼠100％出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，第28天達(dá)最高峰。CCR5 RNA干擾治療后AIA大鼠體重下降程度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)改善，左側(cè)關(guān)

9、節(jié)腫脹度明顯改善。
　　5、CCR5 RNA干擾治療后AIA大鼠局部滑膜病理學(xué)評(píng)分明顯改善(P＜0.05)對(duì)側(cè)未觀察到改善。
　　6、CCR5 RNA干擾治療后滑膜CCR5蛋白及mRNA表達(dá)均明顯降低(P＜0.01)
　　結(jié)論:
　　1、D1 siRNA組與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、陰性序列對(duì)照組、其它siRNA組比較，能有效抑制大鼠CCR5的蛋白表達(dá)。
　　2、D1 siRNA組與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組、過表達(dá)CCR5質(zhì)粒組、

10、陰性序列對(duì)照組比較，能有效抑制大鼠CCR5 mRNA表達(dá)。
　　3、D1 siRNA針對(duì)大鼠CCR5 mRNA的靶序列為CAGGGATCTATCACATTGGTT。
　　4、CCR5 RNA干擾治療可以改善AIA大鼠的臨床癥狀及關(guān)節(jié)炎指數(shù)，明顯改善AIA大鼠的局部關(guān)節(jié)腫脹度。
　　5、CCR5 RNA干擾治療可以明顯改善AIA大鼠局部關(guān)節(jié)的病理過程。
　　6、CCR5 RNA干擾治療主要作用于局部關(guān)節(jié)，對(duì)對(duì)側(cè)及雙