催乳素對佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠VEGF表達(dá)的影響.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種機(jī)體免疫異常引起的，以滑膜組織炎性增生，關(guān)節(jié)破壞為特點(diǎn)的炎性疾病。近年來，人們在對RA機(jī)體全身的免疫學(xué)機(jī)制異常進(jìn)行討論的同時，對滑膜本身病變在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸重視。研究發(fā)現(xiàn)，RA的滑膜組織是一種具有很強(qiáng)侵蝕作用的病變組織，它的生長及病理學(xué)行為在許多方面類似于腫瘤組織的特性：滑膜組織表現(xiàn)為增生性侵蝕性生長，滑膜組織肥厚，血管翳形成。在滑膜病變的發(fā)展過程中有多種炎性

2、因子和生長因子的參與，其中血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)，可能對滑膜炎癥的發(fā)展及滑膜血管翳的形成具有十分重要的作用。 催乳素(prolactin，PRL)是由垂體前葉合成和分泌的具有多種生理功能的激素，對其免疫調(diào)節(jié)作用的研究在近二十年異軍突起。多項(xiàng)研究證實(shí)PRL具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，其中PRL與自身免疫疾病的關(guān)系也引起了人們極大的關(guān)注。臨床觀察和動物實(shí)驗(yàn)均已證明PR

3、L與許多自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性Addison氏病、自身免疫性甲狀腺疾病等密切相關(guān)。有關(guān)RA病人血清中PRL濃度的變化已有大量報道，多數(shù)研究證實(shí)RA病人血清中PRL濃度升高，并且PRL水平與RA病情呈正相關(guān)。 PRL在RA發(fā)病中作用機(jī)制比較復(fù)雜，目前認(rèn)為，PRL可影響RA發(fā)病的多個環(huán)節(jié)，包括對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、與炎性介質(zhì)的相互作用、對細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)等，但其確切機(jī)制還在進(jìn)一步研究之中。本試驗(yàn)以完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的雄性

4、關(guān)節(jié)炎大鼠為研究對象，觀察高PRL血癥和低PRL血癥時關(guān)節(jié)滑膜VEGF表達(dá)的變化，旨在討論P(yáng)RL與VEGF表達(dá)的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明PRL在RA發(fā)病過程的作用機(jī)制以及為RA的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料和方法一、實(shí)驗(yàn)動物雄性Wistar大鼠40只，6-8周齡，體重約160±20克。 二、主要試劑完全弗氏佐劑、乙烯雌酚、溴隱亭均購自美國SIGMA公司，兔抗鼠VEGF抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白均購自武漢博士德公司，ECL

5、試劑盒、SP免疫組化試劑盒、硝酸纖維素膜均購自北京中山生物制劑公司。 三、主要實(shí)驗(yàn)儀器勻漿機(jī)，臺式低溫超速離心機(jī)，分光光度儀，電泳槽、電泳儀、轉(zhuǎn)印儀，恒溫冰凍切片機(jī)，Luzex-F實(shí)時圖像分析系統(tǒng)。 實(shí)驗(yàn)方法雄性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為以下四組：正常組；關(guān)節(jié)炎組；低PRL關(guān)節(jié)炎組；高PRL關(guān)節(jié)炎組。于誘導(dǎo)佐劑關(guān)節(jié)炎后21天將動物全部斷頭處死，同時留取血清標(biāo)本，應(yīng)用放射免疫方法測定血清中PRL含量。取出關(guān)節(jié)滑膜組織

6、于液氮中冷凍10分鐘后，置于-70℃深低溫冰箱中保存，用WesternBlot方法測定其VEGF的表達(dá)。取膝關(guān)節(jié)滑膜于4％多聚甲醛中固定一周，用30％蔗糖沉淀24小時后，制作冰凍切片，用免疫組化SP法測定VEGF的表達(dá)。 采用SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計分析方法采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、放射免疫法血清PRL含量的測定結(jié)果：關(guān)節(jié)炎組

7、PRL水平高于正常組(625.34±30.6vs.495.59±21.2，p＜0.05)；高催乳素關(guān)節(jié)炎組血清PRL水平高于關(guān)節(jié)炎組(695.67±30.8vs.625.34±30.6，p＜0.05)；低催乳素關(guān)節(jié)炎組血清PRL水平低于關(guān)節(jié)炎組(562.08±28.2vs.625.34±30.6，p＜0.05)。 2、WesternBlot測定膝關(guān)節(jié)滑膜組織VEGF的表達(dá)水平：每個樣品均進(jìn)行了VEGF蛋白帶和β-actin蛋白帶

8、的IDV值的測定。四組間VEGF表達(dá)水平取IDV值與對應(yīng)β-actin的IDV值的比值兩兩相比，關(guān)節(jié)炎組PRL水平高于正常組(1.2941±0.0295vs.0.8761±0.0198，p＜0.05)；高催乳素關(guān)節(jié)炎組血清PRL水平高于關(guān)節(jié)炎組(1.5387±0.0376vs.1.2941±0.0295，p＜0.05)；低催乳素關(guān)節(jié)炎組血清PRL水平低于關(guān)節(jié)炎組(1.0082±0.0264vs.1.2941±0.0295，p＜0.05)

9、。 3、免疫組化SP法測定膝關(guān)節(jié)滑膜組織VEGF的表達(dá)結(jié)果：各組滑膜細(xì)胞均有棕色顆粒，著色部位在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，細(xì)胞核無著色。正?；ぜ?xì)胞僅表達(dá)少量VEGF，關(guān)節(jié)炎組陽性顆粒及含陽性顆粒的細(xì)胞數(shù)明顯多于正常組，高催乳素關(guān)節(jié)炎組陽性顆粒最明顯，低催乳素關(guān)節(jié)炎組陽性顆粒較關(guān)節(jié)炎組有所減少。 討論P(yáng)RL與RA關(guān)系的研究已有較多報道，臨床觀察已經(jīng)證實(shí)RA患者存在PRL分泌異常，并且體內(nèi)PRL水平與病情呈正相關(guān)。動物實(shí)驗(yàn)也表明，佐

10、劑誘導(dǎo)的RA大鼠發(fā)病過程中血清中PRL濃度升高，給予能抑制其分泌的多巴胺受體激動劑溴隱亭(brocriptine，BRC)后病情好轉(zhuǎn)。去垂體大鼠不僅免疫功能低下，而且不能誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎，植入垂體或給予外源性PRL后免疫功能恢復(fù)，又能誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎。這表明PRL在RA發(fā)病過程中是不可缺少的。 VEGF能特異的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF與受體結(jié)合后，引起內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增生。VEGF還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種組織蛋白酶以降解細(xì)胞外

11、基質(zhì)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和浸潤，誘導(dǎo)新生血管形成。RA病人的滑液和滑膜中富含VEGF，VEGF不但對單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞有趨化激活作用，而且能促進(jìn)纖維母細(xì)胞增生和促進(jìn)b-FGF等炎性介質(zhì)的分泌，進(jìn)而加重關(guān)節(jié)及周圍組織破壞。同時RA中過度表達(dá)的VEGF能誘導(dǎo)尿激酶和組織性的纖溶酶原激活因子的產(chǎn)生，促進(jìn)纖溶酶的釋放，進(jìn)而激活金屬蛋白酶，加重關(guān)節(jié)軟骨的破壞。 本實(shí)驗(yàn)研究以CFA誘導(dǎo)的佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠作為RA的動物模型，采用皮下埋置

12、含乙烯雌酚硅膠管的方法制造高催乳素血癥模型，采用溴隱亭灌胃的方法制造低催乳素血癥模型，觀察在體內(nèi)高催乳素狀態(tài)下和低催乳素狀態(tài)下關(guān)節(jié)組織VEGF的表達(dá)。結(jié)果表明大鼠誘導(dǎo)佐劑關(guān)節(jié)炎后，關(guān)節(jié)滑膜VEGF的表達(dá)明顯高于正常組，在體內(nèi)高催乳素水平時，VEGF的表達(dá)明顯高于關(guān)節(jié)炎組，而低催乳素水平時，VEGF表達(dá)低于關(guān)節(jié)炎組。 PRL影響RA發(fā)病的作用機(jī)制是多方面的，主要包括對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、與炎性介質(zhì)的相互作用、對細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)。由本

13、實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，催乳素可能是通過影響關(guān)節(jié)組織對VEGF的分泌而影響RA發(fā)病的。已有報道用催乳素和溴隱亭處理RA病人關(guān)節(jié)滑膜后發(fā)現(xiàn)其分別可以刺激與抑制炎性因子和蛋白水解酶的產(chǎn)生，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上結(jié)論是一致的。綜上所述，本研究首次證實(shí)了AA大鼠體內(nèi)PRL水平可影響關(guān)節(jié)組織VEGF的表達(dá)，高催乳素血癥可增加佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜VEGF的產(chǎn)生，給予溴隱亭抑制PRL釋放引起低催乳素血癥時，VEGF的產(chǎn)生減少。但是VEGF的變化是PRL直接刺激產(chǎn)生還是