基因組編輯技術(shù)在果蠅染色體改造中的綜合應(yīng)用.pdf

1、果蠅作為一種重要的模式生物，從其被發(fā)現(xiàn)具有重要的科學(xué)研究價值開始，不同的新技術(shù)在果蠅中的成熟應(yīng)用，使得果蠅在生命科學(xué)的研究中扮演著越來越重要的角色。尤其是在新基因的篩選和基因新功能的發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域內(nèi)，有著其他模式生物不可比擬的優(yōu)勢。
　　P-element是一類轉(zhuǎn)座子，在轉(zhuǎn)座酶的催化下能夠?qū)⑵渖蠑y帶的DNA序列隨機(jī)的插入到果蠅的染色體組上，是果蠅的基因組編輯中運(yùn)用最為廣泛的一種技術(shù)。Talens(transcription activa

2、tor-like effector nucleases)和CRISPR/sgRNA(CRISPR-assoeiated single-guide RNA system)是最近幾年發(fā)現(xiàn)的基因組編輯的新技術(shù)。Talens是transcription activator-like effectors(TALEs)和FokⅠ nuclease的融合蛋白，每個TALEs蛋白上有一個能夠結(jié)合特異性DNA序列保守中心區(qū)域。通過不同單體拼接就能夠構(gòu)建出

3、一個識別特異性的DNA序列的TALEs蛋白，通過左右臂兩個不同的TALEs結(jié)合基因組上相近的DNA序列，F(xiàn)okⅠ核酸酶形成具有活性的二聚體結(jié)構(gòu)，剪切識別序列中間的間隔序列，在基因組上產(chǎn)生DBS(double-strand breaks)。這種基因組損傷主要通過兩種機(jī)制修復(fù):nonhomologous end joining(NHEJ)和homologous recombination(HR)，由此就能對基因組上進(jìn)行knock in和kn

4、ock out編輯。CRISPR/sgRNA系統(tǒng)和TALENs系統(tǒng)對基因組進(jìn)行編輯的機(jī)制是一樣的，通過編輯包含有20nt特異性的基因組識別序列的sgRNA，可以結(jié)合不同的基因組序列，然后募集Cas9核酸酶來剪切靶位點基因組序列產(chǎn)生DBS。
　　本實驗分為三大部分，第一部分是利用傳統(tǒng)的P-element技術(shù)在果蠅的四號染色體上引入FRT位點。通過構(gòu)建帶有FRT位點的P-element質(zhì)粒，并將其注射到果蠅受精卵里，通過后續(xù)的雜交過程

5、，成功將FRT位點引入到果蠅的Ⅳ號染色體離著絲粒約3/4位置上;第二部分在實驗室現(xiàn)有的條件下，引進(jìn)果蠅基因組編輯的新技術(shù)Talens和CRISPR/sgRNA系統(tǒng)，主要目的根據(jù)實驗室的技術(shù)條件對Talens和CRISPR/sgRNA技術(shù)的進(jìn)行實際的應(yīng)用和優(yōu)化，為今后實驗室開展果蠅基因組編輯相關(guān)實驗提供可靠的實驗系統(tǒng)。通過Talens技術(shù)對Zfh啟動子上的Ci結(jié)合位點和Stat結(jié)合位點進(jìn)行定點突變，分別得到了23和1個品系穩(wěn)定遺傳突變體用

6、于后續(xù)的研究工作;再利用CRISPR/sgRNA對果蠅的CG8060外顯子上的兩個不同位點進(jìn)行定點的突變，分別得到了5個和2個品系的穩(wěn)定遺傳的突變體，比對其表型進(jìn)行后續(xù)的研究。第三部分的工作，是嘗試通過結(jié)合基因組編輯的傳統(tǒng)技術(shù)和新技術(shù)，將FRT位點引入到Ⅳ染色體上更靠近于著絲粒的位置。通過Talens的技術(shù)尚未成功的引入FRT位點，轉(zhuǎn)而優(yōu)化實驗條件，通過Cas9進(jìn)行位點篩選與鑒定，再通過同源重組的方法引入FRT位點。目前已經(jīng)篩選到了合適