基因組編輯技術在果蠅染色體改造中的綜合應用.pdf

1、果蠅作為一種重要的模式生物，從其被發(fā)現具有重要的科學研究價值開始，不同的新技術在果蠅中的成熟應用，使得果蠅在生命科學的研究中扮演著越來越重要的角色。尤其是在新基因的篩選和基因新功能的發(fā)現領域內，有著其他模式生物不可比擬的優(yōu)勢。
　　P-element是一類轉座子，在轉座酶的催化下能夠將其上攜帶的DNA序列隨機的插入到果蠅的染色體組上，是果蠅的基因組編輯中運用最為廣泛的一種技術。Talens(transcription activa

2、tor-like effector nucleases)和CRISPR/sgRNA(CRISPR-assoeiated single-guide RNA system)是最近幾年發(fā)現的基因組編輯的新技術。Talens是transcription activator-like effectors(TALEs)和FokⅠ nuclease的融合蛋白，每個TALEs蛋白上有一個能夠結合特異性DNA序列保守中心區(qū)域。通過不同單體拼接就能夠構建出

3、一個識別特異性的DNA序列的TALEs蛋白，通過左右臂兩個不同的TALEs結合基因組上相近的DNA序列，FokⅠ核酸酶形成具有活性的二聚體結構，剪切識別序列中間的間隔序列，在基因組上產生DBS(double-strand breaks)。這種基因組損傷主要通過兩種機制修復:nonhomologous end joining(NHEJ)和homologous recombination(HR)，由此就能對基因組上進行knock in和kn

4、ock out編輯。CRISPR/sgRNA系統和TALENs系統對基因組進行編輯的機制是一樣的，通過編輯包含有20nt特異性的基因組識別序列的sgRNA，可以結合不同的基因組序列，然后募集Cas9核酸酶來剪切靶位點基因組序列產生DBS。
　　本實驗分為三大部分，第一部分是利用傳統的P-element技術在果蠅的四號染色體上引入FRT位點。通過構建帶有FRT位點的P-element質粒，并將其注射到果蠅受精卵里，通過后續(xù)的雜交過程

5、，成功將FRT位點引入到果蠅的Ⅳ號染色體離著絲粒約3/4位置上;第二部分在實驗室現有的條件下，引進果蠅基因組編輯的新技術Talens和CRISPR/sgRNA系統，主要目的根據實驗室的技術條件對Talens和CRISPR/sgRNA技術的進行實際的應用和優(yōu)化，為今后實驗室開展果蠅基因組編輯相關實驗提供可靠的實驗系統。通過Talens技術對Zfh啟動子上的Ci結合位點和Stat結合位點進行定點突變，分別得到了23和1個品系穩(wěn)定遺傳突變體用

6、于后續(xù)的研究工作;再利用CRISPR/sgRNA對果蠅的CG8060外顯子上的兩個不同位點進行定點的突變，分別得到了5個和2個品系的穩(wěn)定遺傳的突變體，比對其表型進行后續(xù)的研究。第三部分的工作，是嘗試通過結合基因組編輯的傳統技術和新技術，將FRT位點引入到Ⅳ染色體上更靠近于著絲粒的位置。通過Talens的技術尚未成功的引入FRT位點，轉而優(yōu)化實驗條件，通過Cas9進行位點篩選與鑒定，再通過同源重組的方法引入FRT位點。目前已經篩選到了合適