利用DNA洗牌技術(shù)構(gòu)建GRATEN體系用于基因組編輯的研究.pdf

1、基因突變一直是研究基因功能的最有效方法。隨著現(xiàn)代基因組測序技術(shù)的迅速發(fā)展，大量的基因或其調(diào)控因子功能需要鑒定。因此建立精確、高效的基因組定點突變技術(shù)，運用反向遺傳學(xué)方法研究基因（或 DNA）的功能是當(dāng)前功能基因組學(xué)研究的熱點之一。人工介導(dǎo)的鋅指核酸酶技術(shù)（ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（TALEN）和RNA介導(dǎo)的規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)系統(tǒng)都可以精確地在基因組的特定位點上產(chǎn)生DNA雙鏈切口，進(jìn)而經(jīng)細(xì)胞內(nèi)源性

2、修復(fù)機(jī)制（同源重組修復(fù)或非同源末端連接）的修復(fù)而實現(xiàn)基因插入、缺失和堿基替換等突變。與傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)相比，基因編輯新技術(shù)不僅保留了可定點修飾的特點，還可應(yīng)用到更多的物種上，大大提高了基因定點突變效率，其載體的構(gòu)建時間縮短，成本降低，為實現(xiàn)基因組定點突變提供廣闊的平臺。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR系統(tǒng)脫靶率非常高。
　　本研究利用DNA洗牌技術(shù)一次性克隆多個基因，并實現(xiàn)一次性定點突變二個氨基酸位點。利用DNA洗牌技術(shù)構(gòu)建

3、了表達(dá)載體，首次在植物中利用引導(dǎo) RNA偶聯(lián)核酸內(nèi)切酶(guided RNA and tethered endonuclease，GRATEN)用于基因組編輯，研究GRATEN系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)在植物基因組中定點突變的可能性。在煙草葉片中瞬時表達(dá)，并進(jìn)行了致突變的初步研究。
　　GRATEN系統(tǒng)包含蛋白質(zhì)和RNA二部分，將二組分克隆到同一植物表達(dá)載體。蛋白質(zhì)組分包含來自于噬菌體MS2外殼蛋白（MS2 coat protein

4、，MCP）和核酸內(nèi)切酶FokI的切割結(jié)構(gòu)域，MCP的N和C端分別融合FokI，表達(dá)后形成FokI:MCP:FokI融合蛋白。RNA組分包含串聯(lián)的指導(dǎo)RNA（guided RNA，gRNA）和MCP結(jié)合RNA。gRNA與目標(biāo)DNA通過堿基配對而識別并結(jié)合到靶DNA，MCP以二聚體的形式與形成特定二級結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合，由此在靶DNA特定位點形成FokI二聚體，切割DNA，產(chǎn)生雙鏈斷裂，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)修復(fù)機(jī)制（主要為非末端連接，Non-Homolo

5、gous End Joining，NHEJ）產(chǎn)生堿基替換、缺失和插入等突變。
　　利用GRATEN系統(tǒng)，我們選擇本氏煙草（Nicotiana benthamiana）八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS）基因作為打靶基因。結(jié)果顯示可產(chǎn)生較高（約35.7％）基因突變率。我們的研究結(jié)果初步說明GRATEN系統(tǒng)可用于植物（有可能在其他生物）基因組定點突變，為功能基因組研究、基因治療等提供了一種新的設(shè)計思路和