實(shí)驗(yàn)28 植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)28植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，測(cè)其含量是了解植物體總代謝的一個(gè)重要指標(biāo)。在研究每一種酶的作用時(shí)，常以比活（酶活力單位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制劑純度。因此，測(cè)定植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)是研究酶活的一個(gè)重要項(xiàng)目。常用測(cè)定方法有Lowry法和考馬斯亮藍(lán)G250染料結(jié)合法。本實(shí)驗(yàn)將分別介紹這兩種方法。一、考馬斯亮藍(lán)法【原理】考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。考馬斯

2、亮藍(lán)G250在游離態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌罢咦畲蠊馕赵?65nm，后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0～100μgml），蛋白質(zhì)－色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比。故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應(yīng)非常靈敏，可測(cè)微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，所以是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法?！緝x器與用

3、具】分光光度計(jì)，10ml量筒1支；研體；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度試管14支?！驹噭浚?）牛血清白蛋白配成1000μgml和100μgml；（2）考馬斯亮藍(lán)G250：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G250溶于50ml90%乙醇中，加入85%（WV）磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在常溫下可放置一個(gè)月；（3）90%乙醇；（4）磷酸（85%，WV）。【方法】1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）0～100μ

4、gml標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支試管，按表281數(shù)據(jù)配制0～100μgml血清白蛋白液各1ml。準(zhǔn)確吸取所配各管溶液0.1ml，分別放入10ml具塞試管中，加入5ml考馬斯亮藍(lán)G250試劑，蓋塞，反轉(zhuǎn)混合數(shù)次，放置2min后，在595nm下比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表281配制0～100μgml血清白蛋白液管號(hào)123456100μgml牛血清蛋白量(ml)蒸餾水量(ml)蛋白質(zhì)含量(mg)01.000.20.80.020.40.60.040.60.

5、40.060.80.20.081.000.10（2）0～1000μgml標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作另取6支試管，按表282數(shù)據(jù)配制0～1000μgml牛血清白蛋白溶液各1ml。與步驟（1）操作相同，繪出0～1000μgml的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表282配制0～1000μgml血清蛋白血液管號(hào)7891011121000μgml牛血清白蛋白（ml）蒸餾水量(ml)蛋白質(zhì)含量(mg)01.000.20.80.20.40.60.40.60.40.60.80.20.8

6、1.001.02.樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定吸取樣品提取液0.1ml（樣品提取見(jiàn)各酶活測(cè)定），放入具塞刻度試管中（設(shè)兩個(gè)重復(fù)管），加入5ml考馬斯亮藍(lán)G250試劑，充分混合，放置2min后在595nm下比色，記錄吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。3.結(jié)果計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量（mgg鮮重）=WaVC?式中C－查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得每管蛋白質(zhì)含量（mg）；V－提取液總體積（ml）；a－測(cè)定所取提取液體積（ml）；W－取樣量（g）。二、LOWRY

7、法【原理】Lowry法是雙縮脲法和福林酚法的結(jié)合與發(fā)展，其原理是：蛋白質(zhì)溶液用堿性銅溶液處理，形成銅蛋白質(zhì)的絡(luò)合鹽，再加入酚試劑后，除使肽鏈中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲法中肽鍵、堿性銅的顯色效果更強(qiáng)烈。因此，Lowry法的顯色效果比單獨(dú)使用酚試劑強(qiáng)烈3～15倍，為雙縮脲法100倍。由于肽鍵顯色效果增強(qiáng)，從而減小了因蛋白質(zhì)種類引起的偏差。Lowry法的試劑由兩部分組成，試劑甲相當(dāng)于雙縮脲試劑（堿性銅溶液），可與蛋白質(zhì)中的