蛋白質(zhì)含量測定方法比較

1、蛋白質(zhì)含量測定主要有五種方法，分別是凱式定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、酚試劑法和考馬斯亮藍法。這五種方法各有特點，優(yōu)缺點明確。凱氏定氮法蛋白質(zhì)是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，留在消化液中，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量來乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量。因為食品中除蛋白質(zhì)外，還含有其它含氮物質(zhì)，所以此蛋白質(zhì)稱為粗蛋白。優(yōu)點：重現(xiàn)性好

2、，是目前分析有機化合物含氮量常用的方法是一種蛋白質(zhì)測定的經(jīng)典方法測試結(jié)果準(zhǔn)確。缺點：操作比較繁復(fù)，費時試劑消耗量大。且此法測定的蛋白質(zhì)含量實際上包括了核酸，生物堿，含氮類脂，卟啉，含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物。雙縮脲定氮法雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子

3、相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。優(yōu)點：較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進行紫

4、外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定樣品時的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。酚試劑法此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍色的原因是：?在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。?Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍色（鉬蘭

5、和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，藍色深度與蛋白的量成正比。優(yōu)點：靈敏度高比雙縮脲法靈敏約100倍。操作簡單，不需要特殊儀器設(shè)備。缺點：費時間較長，要精確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%）