dna限制性?xún)?nèi)切酶消化酶切

1、實(shí)驗(yàn)三 DNA限制性?xún)?nèi)切酶 消化酶切,實(shí)驗(yàn)原理,限制性?xún)?nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱(chēng)為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。,限制性?xún)?nèi)切酶可分為三類(lèi),Ⅱ類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶,Ⅱ類(lèi)酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱(chēng)軸處切割, 產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱(chēng)軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱(chēng)粘性末端，如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互

2、補(bǔ)的粘性末端。 5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5',實(shí)驗(yàn)材料和試劑,實(shí)驗(yàn)材料： 玉米基因組DNA實(shí)驗(yàn)試劑：BamH I 酶及其酶切緩沖液：購(gòu)買(mǎi)成品。 SalI酶及其酶切緩沖液：購(gòu)買(mǎi)成品。瓊脂糖(Agarose)：進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均

3、可。,實(shí)驗(yàn)儀器,恒溫水浴鍋,,用手指輕彈管壁使溶液混勻，使溶液集中在管底,混勻反應(yīng)體系后，37℃水浴保溫2-3h,電泳檢測(cè),EP管編號(hào),,,,實(shí)驗(yàn)步驟,反應(yīng)體系 20μL酶液 DNA 15μL BamHⅠ 1μL SalⅠ 1μL 10×BufferT

4、 3μL,對(duì)質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng),限制性?xún)?nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA加1單位酶, 消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。,電泳檢測(cè)示例,實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng),限制性?xún)?nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA加1單位酶，消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。 酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會(huì)干擾酶反

5、應(yīng)。 許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過(guò)量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。 市場(chǎng)銷(xiāo)售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見(jiàn)，使用時(shí)可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1×）進(jìn)行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則酶活性將受影響。,思考題,如果一個(gè)DNA酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)DNA未被酶切或者酶切不完全, 你認(rèn)為可能是什么原因？,