限制性內(nèi)切酶酶切位點保護堿基

1、寡核苷酸近末端位點的酶切寡核苷酸近末端位點的酶切(Cleavage(CleavageCloseClosetotothetheEndEndofofDNADNAFragmentsFragments(oligonucleotides))(oligonucleotides))為了解不同內(nèi)切酶對識別位點以外最少保護堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進行實驗。實驗結(jié)果對于確定雙酶切順序?qū)袔椭ū热缭诙嘟宇^上

2、切割位點很接近時），或者當(dāng)切割位點靠近DNA末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識別位點兩端至少加上6個保護堿基，以確保酶切反應(yīng)的進行。實驗方法：用γ[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記0.1A260單位的寡核苷酸。取1g已標(biāo)記了的寡核苷酸與20單位的內(nèi)切酶，在20C條件下分別反應(yīng)2小時和20小時。反應(yīng)緩沖液含70mMTrisHCl(pH7.6)10mMMgCl25mMDTT及適量的NaCl或KCl（視酶的具體要

3、求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實驗采用自連接的寡核苷酸作為對照。若底物有較長的回文結(jié)構(gòu)，切割效率則可能因為出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低。DNA合成，新鏈的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位點因為內(nèi)切酶除了有特異的識別位點之外，還需多幾個無需特異性的堿基提供一個platfm讓它可以結(jié)合上去，否則會掉下來.引物的結(jié)構(gòu)就是（5→3）：保護堿基酶切位點原來的引物序列首先要看目的基因中是否含有該酶

4、切位點，只有沒有的才可以選(小蝦米酶切位點分析)。其次，如果需要做表達，需要考慮起始密碼子，防止移碼突變切割率切割率%酶寡核苷酸序列寡核苷酸序列鏈長鏈長2hr20hrAccIGGTCGACCCGGTCGACCGCCGGTCGACCGG81012000000AflIIICACATGTGCCACATGTGGCCCACATGTGGG810120909009090IGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA8101290909

5、0909090AvaICCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGA81012509090909090GGAATTCCATATGGAATTCCGGGAATTCCATATGGAATTCCC202275759090NheIGGCTAGCCCGGCTAGCCGCTAGCTAGCTAG810120101002550NotITTGCGGCCGCAAATTTGCGGCCGCTTTAAAATATGCGGCCGCTATAAAATAAGAA

6、TGCGGCCGCTAAACTATAAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA1216202428010102525010109090NsiITGCATGCATGCACCAATGCATTGGTTCTGCAGTT122210909090PacITTAATTAAGTTAATTAACCCTTAATTAAGG8101200002590PmeIGTTTAAACGGTTTAAACCGGGTTTAAACCCAGCTTTGTTTAAACGG

7、CGCGCCGG8101224000750255090PstIGCTGCAGCTGCACTGCAGTGCAAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8142224260109090001090900PvuICCGATCGGATCGATCGATTCGCGATCGCGA81012010002510SacICGAGCTCG81010SacII