實驗五 dna的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)(定稿)

1、實驗五實驗五DNA的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)DNArestrictionenzymedigestion一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗掌握DNA的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的基本原理與實驗過程。二、實驗原理二、實驗原理限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)

2、合于識別位點并隨機(jī)的切割識別位點不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成:一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)它切割某一特異的核苷酸序列另一種為獨立的甲基化酶它修飾同一識別序列。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcⅠ識別六個核苷酸序列:5G↓AATTC3)有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中有的在對稱軸處切割產(chǎn)生平末端的DNA片段(如S

3、ma:5CCC↓GGG3)有的切割位點在對稱軸一側(cè)產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端如EcⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補(bǔ)的粘性末端。5…G↓AATTC…3→5…GAATTC…3；3…CTTAA↑G…5→3…CTTAAG…5。PvuI的識別序列5…ＣＧＡＴ↓ＣＧ…3→5…ＣＧＡＴＣＧ…3三、實驗儀器與設(shè)備三、實驗儀器與設(shè)備水平式電泳裝置電泳儀臺式高速離心機(jī)恒溫水浴鍋微量移液槍微波爐紫外透射儀凝膠成像系統(tǒng)四、實驗材料與試劑四、實驗材料

4、與試劑pUC18質(zhì)粒：2686bp，0.5μgμl，40μl管（日本東洋紡織株式會社）PvuI酶及其酶切緩沖液：10Uμl，200U管（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司），在pUC18質(zhì)粒上有兩個酶切位點，分別為酶切第一個堿基位是276（896bp）、2066（1790bp)10X的酶切反應(yīng)體系（使用時酶切反應(yīng)體系為1X）乙醇，混勻后置70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個酶切反應(yīng)。4.在酶切圖譜制作過程中，為了獲得

5、條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.51μg。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μgDNA加1單位酶消化12小時。但要完全酶解則必須增加酶的用量一般增加23倍甚至更多反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。（DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。構(gòu)建D

6、NA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置。酶切圖譜的使用價值依賴于它的準(zhǔn)確性和精確程度。）5、許多實驗制備的DNA不易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。6、市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1）進(jìn)行稀釋。另