天藍色鏈霉菌中IV型限制性內(nèi)切酶Sco5333功能研究.pdf

1、鏈霉菌是一種革蘭氏陽性細菌，具有復(fù)雜的生活周期和產(chǎn)生多樣的次級代謝產(chǎn)物，其中目前已知的70％的抗生素都是由鏈霉菌產(chǎn)生的。
　　模式菌株天藍色鏈霉菌具有至少四種甲基化依賴型的限制系統(tǒng)，使外源甲基化DNA難以進入宿主，對鏈霉菌的研究造成了障礙。
　　我們發(fā)現(xiàn)位于天藍色鏈霉菌基因組島Gi-12上的sco5333基因是一個IV型限制性內(nèi)切酶基因，其表達載體DNA不能轉(zhuǎn)入含有Dcm甲基化修飾的大腸桿菌中；當大腸桿菌含有sco5333基

2、因時，攜帶dcm基因的外源DNA進入該宿主的效率同樣下降90%以上。
　　Sco5333包含N端的SRA(SET-and RING-associated domain)結(jié)構(gòu)域和C端HNH模體。該HNH模體還偶聯(lián)一個組成為CX2CX36CX2C的典型鋅指結(jié)構(gòu)。
　　點突變分析證明Sco5333的體內(nèi)限制活性需要SRA與HNH共同作用。在體外SRA結(jié)構(gòu)域負責結(jié)合5-甲基胞嘧啶DNA，HNH模體負責DNA的切割。
　　Sco

3、5333在體外能夠結(jié)合Dcm甲基化的pUC18質(zhì)粒DNA，而對非甲基化DNA沒有結(jié)合。進一步研究發(fā)現(xiàn)Sco5333對M.AluI，M.HhaI,
　　M.HpaII，M.MspI，CpG，GpC及Dcm等7種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶修飾的219 bp DNA分別都能結(jié)合。對一段55 bp DNA上5mC兩側(cè)的堿基進行飽和突變發(fā)現(xiàn)：Sco5333對含有5mC的所有全甲基化、半甲基化的DNA，以及含5mC的單鏈DNA均能結(jié)合。

4、>　　Sco5333在體外對pUC18質(zhì)粒DNA有非常微弱的切割活性，且其切割沒有甲基化特異性及序列特異性。
　　Zn2+能夠顯著增強Sco5333對5mC DNA的結(jié)合，并能抑制Sco5333在Mg2+，Mn2+存在下的切割活性。把鋅指結(jié)構(gòu)破壞后的點突變蛋白
　　Sco5333C252D的切割活性明顯增加，且在Zn2+存在下也有微弱活性，但Sco5333C252D在Mg2+，Mn2+存在下的切割活性仍能被Zn2+抑制。我們

5、討論并提出了Zn2+可能影響Sco5333結(jié)合及切割DNA的模型。
　　最后我們考察了sco5333所在的基因組島Gi-12的可移動性，證明它是一個攜帶IV型限制系統(tǒng)的放線菌整合型接合元件(AICE)。
　　我們鑒定了Sco5333是一個IV型限制性內(nèi)切酶，并研究了它對5mC DNA的結(jié)合及切割特性，為天藍色鏈霉菌多重限制系統(tǒng)的進一步研究打下了良好的基礎(chǔ)。Sco5333具有相當高的5mC序列識別寬泛性及對非5mC序列的不敏感