產(chǎn)黃青霉谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、表達(dá)與功能研究.pdf

1、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferase，GST，EC 2.5．1.18)是具有多種生理功能的二聚體同功酶家族，催化細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽與各種內(nèi)源或外源的親電子有毒分子結(jié)合以達(dá)到解毒的目的。目前有關(guān)GST的研究大多集中在動(dòng)物、植物、昆蟲等生物體中，而對(duì)于真菌尤其是絲狀真菌中的產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum Thom)GST的報(bào)道較少。 本研究以產(chǎn)黃青霉cDNA為模板，克隆得了兩個(gè)新的

2、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因PcgstB和PcgstC，與GenBank中已知序列進(jìn)行BLASTp比較顯示，二者均具有保守的GST結(jié)構(gòu)域。將基因PcgstB和PcgstC分別與載體pTrc99A和pET-39b(+)連接，構(gòu)建了兩種目的基因的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了重組蛋白PcGstB和PcGstC。 分別采用glutathione-agarose親和層析及包涵體溶解、復(fù)性的方法，對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行了純化，并

3、以1-ehloro-2，4-dinitrobenzene(CDNB)為底物檢測(cè)純化蛋白PcGstB和PcGstC的比活分別為0.401+0.020U/mg和0.018+0.0017U/mg，表明二者均具有GST活性。采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明在產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)基中加入CDNB 3h后，基因PcgstB和PcgstC的表達(dá)量分別增加了大約3倍和10倍，而PAA和H<,2>O<,2>對(duì)PcgstB和PcgstC基因的表達(dá)水平無顯著影響。

4、 對(duì)PcGstC蛋白的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究顯示，以CDNB為底物測(cè)得蛋白的K<,m(CDNB)值為1.66μmol/ml、V<,max(cDNB)>為0.0422μmol/min/mg，以GSH為底物測(cè)得蛋白的K<,m(GSH)>值為1.73μmol/ml、V<,max(GSH)>為0.0432μmol/min/mg。底物特異性研究表明，除CDNB外，PcGstC同樣能夠催化p-Nitrobenzyl chloride(NBC)、

5、Ethacrynic acid(EA)和4-Nitropyridine-N-oxide(NPNO)與GSH(glutathione，谷胱甘肽)結(jié)合，其比活分別為：0.137±0.005U/rag、0.028±0.003U/rag、0.069±0.006U/mg，而對(duì)1，2-Dichloro-4-nitrobenzene(DCNB)無活性。 本研究結(jié)果為深入研究產(chǎn)黃青霉中GST與GSH、苯乙酸代謝的關(guān)系及其在青霉素生物合成中的作