辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與功能研究.pdf

1、辣椒疫霉菌是一種重要的卵菌植物病原體，它能引起辣椒及其他多種經(jīng)濟(jì)作物發(fā)生枯萎、爛根等病癥。目前辣椒疫霉的防治工作仍然是以傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑防治為主，但由此引起了重金屬超標(biāo)、農(nóng)藥殘留的問題，加之抗病育種工作進(jìn)展緩慢，這一系列問題給人類健康、環(huán)境安全帶來了巨大威脅，嚴(yán)重影響辣椒產(chǎn)量。因此，利用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)對辣椒疫霉菌重要致病因子及其致病機(jī)制進(jìn)行深入的探索已經(jīng)成為了當(dāng)下研究的熱點及重點。
　　有文獻(xiàn)報道，稻瘟病菌利用附著胞入侵植物組

2、織，附著胞先破壞葉片表皮，再向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)展產(chǎn)生傳染性菌絲，而有針對性的刪除編碼過氧化物酶體型的肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶基因PTH2后，產(chǎn)生的突變體完全喪失致病性，證明了過氧化物酶體型的肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶的活性對附著胞的功能是必需的。目前在卵菌中很少有關(guān)于附著胞相關(guān)基因的研究，因此，研究此種類型基因十分必要且意義重大。
　　本研究以本實驗室采集并分離保存的高致病性辣椒疫霉菌株SD33為實驗材料，結(jié)合相關(guān)的研究基礎(chǔ)，對辣椒疫霉菌株SD33中的肉堿脂酰

3、轉(zhuǎn)移酶基因PcCAT進(jìn)行了如下研究:
　　1、辣椒疫霉菌株SD33中PcCAT基因的序列比對、基因克隆、生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析。根據(jù)文獻(xiàn)中報道的CAT基因，利用生物學(xué)軟件從辣椒疫霉菌基因組數(shù)據(jù)庫中成功篩選并克隆得到2個PcCAT基因，分別命名為PcCAT1和PcCAT2。利用多種生物信息學(xué)分析軟件對PcCAT1和PcCAT2兩個基因進(jìn)行多種生物學(xué)信息的預(yù)測及分析。選取不同物種的CAT基因序列做系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示不同物

4、種的CAT基因聚集到了相應(yīng)的不同分支上，說明此基因在卵菌內(nèi)具有一定的保守性。
　　2、PcCAT1和PcCAT2兩個基因在辣椒疫霉不同侵染階段的表達(dá)量分析。用熒光定量PCR的方法對PcCAT1和PcCAT2兩個基因的互作早期表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明兩個基因高效表達(dá)的時間均為游動孢子侵染辣椒寄主4h時，此時基因的表達(dá)量呈明顯上調(diào)趨勢。
　　3、PcCAT1和PcCAT2基因在辣椒疫霉菌SD33內(nèi)的穩(wěn)定沉默和過量表達(dá)。為了進(jìn)一

5、步研究PcCAT1和PcCAT2基因在辣椒疫霉SD33中的功能，利用pHAM34載體構(gòu)建了PcCAT1和PcCAT2全長基因的沉默及過表達(dá)載體，再通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)分別獲得了基因的穩(wěn)定沉默和過量表達(dá)轉(zhuǎn)化子，然后運(yùn)用RT-PCR和熒光定量PCR技術(shù)對兩個基因的表達(dá)水平進(jìn)行了進(jìn)一步的驗證。
　　4、對PcCAT1和PcCAT2基因的沉默及過表達(dá)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行生物學(xué)性狀分析和致病性測定。對各種轉(zhuǎn)化子及野生型菌株SD33的菌絲、

6、孢子囊、附著胞等不同發(fā)育形態(tài)進(jìn)行觀察對比分析，誘導(dǎo)各轉(zhuǎn)化子及野生型菌株SD33的游動孢子并接種辣椒葉片進(jìn)行致病性檢測。用苯胺藍(lán)染色技術(shù)進(jìn)行侵染結(jié)構(gòu)及過程的觀察與分析。
　　通過本項研究，我們可以推測PcCAT基因在辣椒疫霉菌體的自身發(fā)育及對寄主植物的致病過程中發(fā)揮著一定的作用，沉默及過表達(dá)轉(zhuǎn)化子的成功篩選也證明了在P.capsici中可以運(yùn)用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體共轉(zhuǎn)化技術(shù)，為研究辣椒疫霉菌的分子致病機(jī)制提供了一種新的分子生物學(xué)技術(shù)