家蠶肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶BmCPT1基因的鑒定及功能研究.pdf

1、肉堿酰基轉(zhuǎn)移酶家族（carnitine acyltransferase family）是指生物體內(nèi)存在的能和肉堿結(jié)合的一類酶的總稱，這個家族基因的蛋白質(zhì)序列上有一個相似的酶活催化結(jié)構(gòu)域，因此將他們歸為一個家族。此家族包括乙酰基轉(zhuǎn)移酶(carnitine acetyltransferase，CAT)、肉堿辛?；D(zhuǎn)移酶(carnitine oetanoyltransferse，COT)和肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(carnitine palmito

2、yltransferse，CPT)，其中CPT又分為肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyltransferse1，CPT1）和肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶2（carnitine palmitoyltransferse2，CPT2），各主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體和線粒體內(nèi)，不同的酶選擇性的催化不同碳鏈長度的底物。
　　本文基于已測序的家蠶基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，以家蠶肉堿?；D(zhuǎn)移酶家族中長鏈脂肪酸分解關鍵酶BmCPT

3、1基因作為研究對象，對BmCPT1基因進行鑒定、克隆、時空表達分析和功能的研究，探索其在家蠶體內(nèi)脂肪酸代謝過程中的特點。主要研究結(jié)果如下：
　　1、BmCPT1基因的鑒定及序列特征
　　基于家蠶基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，以已報道的黑腹果蠅 CPT1基因的氨基酸序列為問詢序列，進行PSI-BLAST（E＜0.01）同源性檢索得到家蠶BmCPT1基因。獲得1個BmCPT1基因，此基因定位于家蠶CHr.1號性染色體的nscaf306

4、8上，含有肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶特征的兩段跨膜區(qū)域和位于C端的活性催化結(jié)構(gòu)域。ORF框長2337bp，編碼778個氨基酸，具有信號肽序列，沒有發(fā)現(xiàn)可變剪接體。構(gòu)建不同昆蟲物種內(nèi)同源 CPT1基因的序列對比和系統(tǒng)發(fā)生進化樹，發(fā)現(xiàn)昆蟲CPT1基因高度保守。
　　2、BmCPT1基因的表達特征
　　利用逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）和定量PCR（quantitative real ti

5、me polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術，分析BmCPT1基因表達模式。BmCPT1基因在大造幼蟲期及五齡三天不同組織的表達結(jié)果表明，BmCPT1基因在幼蟲期三齡起、四齡起，五齡均表達較高。在大造五齡三天各組織的表達譜中， BmCPT1基因在血液中表達較高，且在不同品種011c、012c、菁松、871和871c間表達譜相似。推斷家幼蟲在發(fā)育變態(tài)時和5齡大蠶時期通過脂肪酸分解代謝功能需求較高。

6、　　3、不同組織的BmCPT1酶活及基因的亞細胞定位
　　取大造五齡三天不同組織，測定BmCPT1酶活，發(fā)現(xiàn)酶活性在頭部最高，絲腺組織最低。酶活性由大到小分別是：頭>表皮>氣管>肌肉>卵巢>馬氏管>精巢>中腸>脂肪體>血液>絲腺。這一結(jié)果與5齡3天不同組織的能量需求是符合的。亞克隆并表達 BmCPT1基因，超純重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，細胞核染料 DAPI和線粒體染料Mitotracker染色后，共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果將BmCPT1基因定

7、位在線粒體。4、BmCPT1基因在不同生長發(fā)育時期及感染細菌后的表達
　　胚胎時期 BmCPT1基因在卵的胚胎發(fā)育中表達量不高，但蟻蠶孵化時表達最高；上簇期間至化蛹3天BmCPT1基因表達呈現(xiàn)較低的水平，且雄性比雌性蠶內(nèi)的BmCPT1基因表達量略高；而化蛹4天后BmCPT1基因表達突然升高，且雌蛹比雄蛹內(nèi)的BmCPT1基因表達量顯著高；雌蛾在羽化后前三天BmCPT1基因表達量比雄性顯著高，羽化三天后開始降低但雌蛾仍高于雄蛾，而雄蛾

8、在羽化后五天之內(nèi)表達量無顯著變化；未交配雄和雌蛾 BmCPT1基因表達沒有顯著變化，但雄蛾BmCPT1基因表達顯著低于雌蛾；雌、雄蛾交配后雌蛾的BmCPT1基因表達下降極顯著，甚至低于雄蛾。綜上所述，BmCPT1基因功能在蛹期雌造卵和成蟲產(chǎn)卵過程中均具有重要作用。
　　對大造、871不同家蠶5齡幼蟲起蠶注射不同病源物大腸桿菌E.coli和黑胸敗血芽胞桿菌Bb，感病狀況下檢測BmCPT1基因的表達。均發(fā)現(xiàn)注射組3h時，雌、雄性蠶Bm

9、CPT1基因表達比對照顯著降低，6h時，在大造和871內(nèi)注射E.coli雄雄蠶和注射Bb雌蠶變化趨勢一致。綜上所述，病菌感染可能引起對脂肪酸氧化供能的利用改變。
　　5、幼蟲和蛹期干涉BmCPT1基因
　　體外注射dsRNA，分子水平檢測均發(fā)現(xiàn)基因表達顯著降低。但注射4齡起蠶時處理組比對照延遲進入眠期4-8小時，注射蛹期沒發(fā)現(xiàn)生物學意義上的顯著變化，僅僅有分子生物學的表達變化。
　　綜上所述，家蠶 BmCPT1基因的表