小立碗蘚羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶基因功能及調(diào)控研究初探.pdf

1、在陸生植物的演化過(guò)程中，苯丙烷類化合物扮演著重要作用。小立碗蘚在進(jìn)化過(guò)程中處于植物從水生向陸生生境進(jìn)化的過(guò)渡階段，研究小立碗蘚的苯丙烷代謝途徑可使我們進(jìn)一步了解苯丙烷類化合物的進(jìn)化歷程。本實(shí)驗(yàn)室此前構(gòu)建了匯集苔蘚植物，單子葉植物與雙子葉植物中研究較多的幾種模式植物BAHD家族基因的進(jìn)化樹(shù)。在其中的一個(gè)進(jìn)化支中，數(shù)種植物的苯丙烷代謝途徑中的HCT功能已經(jīng)鑒定，但小立碗蘚的HCT功能并未報(bào)道。本研究以此為基礎(chǔ)，利用原核表達(dá)、超量表達(dá)、酵母單

2、雜、及煙草熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)研究小立碗蘚PpHCT的功能，為研究小立碗蘚苯丙烷代謝途徑提供依據(jù)。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.通過(guò)PCR獲得PpHCT基因傘長(zhǎng)cDNA序列和部分截短的cDNA序列，并克隆到原核表達(dá)載體pJAM1786上，分別命名為pJC2和pJC1196。將它們轉(zhuǎn)入菌株BL21中表達(dá)，PpHCT獲得可溶性蛋白上清液。利用可溶性蛋白上清液檢測(cè)了PpHCT的底物特異性。HPLC-MS結(jié)果顯示當(dāng)以p-cou

3、maroyl CoA為?；w時(shí)，PpHCT催化反應(yīng)的?；荏w為quinate和shikimate;當(dāng)以caffeoyl CoA，feruloyl CoA為?；w時(shí)，PpHCT催化反應(yīng)的?；荏w只能是shikimate; PpHCT催化反應(yīng)不能以sinapoyl CoA為?；w。PpHCT的底物親和力高低為coumaroyl quinate＞coumaroyl shikimate＞ caffeoyl shikimate＞ ferul

4、oyl shikimate。此結(jié)果說(shuō)明PpHCT具有酰基轉(zhuǎn)移酶功能，但底物廣譜性與其他物種有所區(qū)別。這種區(qū)別可能是PpHCT比其他物種HCT多出一段氨基酸序列所致。
　　 2.通過(guò)gateway克隆將PpHCT全長(zhǎng)cDNA序列和部分截短的cDNA序列構(gòu)建到超表達(dá)載體PH2GW7（含Ubiquitin啟動(dòng)子）和pB7WG2.0上，分別命名為pJC554、pJC557、pJC555和pJC556。通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將pJ

5、C554轉(zhuǎn)化到小立碗蘚原生質(zhì)體中，獲得抗性小立碗蘚植株;通過(guò)擬南芥的蘸花法將pJC555和pJC556轉(zhuǎn)化到擬南芥野生型中，分別得到7和5株T1代陽(yáng)性植株;利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pJC554和pJC557轉(zhuǎn)化到水稻ZH11愈傷，分別得到30和10株T0代陽(yáng)性植株。
　　 3.通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)了pJC554，pJC557轉(zhuǎn)化得到的陽(yáng)性植株分蘗期PpHCT和OsHCT的表達(dá)量和pJC555，pJC556轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株抽苔期Pp

6、HCT和AtHCT的表達(dá)量。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中PpHCT基因都得到了超量表達(dá);同時(shí)，OsHCT與AtHCT在相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株中沒(méi)明顯變化。利用HPLC-MS檢測(cè)了異源超表達(dá)了小立碗蘚PpHCT在抽苔期擬南芥與分蘗期水稻中的PpHCT酶反應(yīng)產(chǎn)物，氨基酸與部分黃酮類物質(zhì)的變化。結(jié)果顯示，在PpHCT陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株中部分酶反應(yīng)產(chǎn)物得到提高，而這種變化在PpHCT-deletion中不存在，說(shuō)明PpHCT序列的完整性對(duì)其功能發(fā)揮是必須的。<

7、br>　　 4.通過(guò)將小立碗蘚基因組中預(yù)測(cè)的R2R3型MYB與擬南芥和水稻中已報(bào)道的調(diào)控木質(zhì)素的MYB進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出可能調(diào)控PpHCT的MYB基因。通過(guò)PCR獲得這些基因的全長(zhǎng)CDNA序列，并克隆到帶35S啟動(dòng)子的載體pB7WG2.0上。同時(shí)通過(guò)PCR獲得PpHCT上游1.9 kb的啟動(dòng)子片段和AtHCT上游1.5 kb的啟動(dòng)子片段克隆到帶熒光素酶報(bào)告基因的載體pGW::Luciferase上。通過(guò)熒光素酶檢測(cè)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)MYB