辣椒疫霉(Phytophthora capsici)多聚半乳糖醛酸酶功能研究及N-糖基化對(duì)其致病性影響.pdf

1、辣椒疫病是一種世界性土傳病害，嚴(yán)重影響我國(guó)及世界各國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病由辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)所引起。辣椒疫霉菌是一種土傳卵菌，在適宜條件下引起青椒莖腐、根腐和枯萎；寄主范圍廣，可以侵染辣椒、西葫蘆、黃瓜、番茄等9科20多種作物。植物病原卵菌與寄主互作過(guò)程中分泌多種重要的細(xì)胞壁降解酶或致病酶，其中多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)是多種植物病原卵菌分泌的一種重要致病酶，通過(guò)降解寄主植

2、物細(xì)胞壁的果膠、中膠層而破壞寄主防御體系，利于病原菌的各種侵染結(jié)構(gòu)、及其分泌的各種致病酶或致病毒素順利侵染寄主組織細(xì)胞而導(dǎo)致寄主的病程發(fā)展。辣椒疫霉菌(P.capsici)作為一種重要的致病卵菌產(chǎn)生多個(gè)多聚半乳糖醛酸酶形成PG基因家族。
　　 N-糖基化通常發(fā)生在側(cè)鏈Asn殘基上由三聯(lián)體Asn-X-Ser/Thr組成，X是除Pro之外的氨基酸。多聚半乳糖醛酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有不同數(shù)量的可能的N-糖基化位點(diǎn)。辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸

3、酶的糖基化可能在其酶活性及致病性中起重要作用，有實(shí)例證明糖基化在蛋白結(jié)構(gòu)，功能和蛋白-蛋白相互作用上有顯著影響。到目前為止真菌N-糖基化的研究還比較少。不同的蛋白或不同位置的糖基化位點(diǎn)對(duì)蛋白的作用是不相同的，所以研究每一個(gè)糖基化位點(diǎn)對(duì)蛋白的功能和穩(wěn)定性的作用非常重要。辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶是一個(gè)大的基因家族，通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)基因具有不同的糖基化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)的多少，糖基化位點(diǎn)的位置，糖基化在基因家族內(nèi)的進(jìn)化都可能直接或間接的影響酶的

4、活性，穩(wěn)定性，進(jìn)而影響辣椒疫霉在侵染寄主時(shí)多聚半乳糖醛酸酶的致病性。作為一種重要的細(xì)胞壁降解酶，多聚半乳糖醛酸酶的N-糖基化是本試驗(yàn)研究的重點(diǎn)。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 選取Pcipg5作為靶標(biāo)基因，研究其功能與致病性的關(guān)系。利用RT-PCR，Northern雜交，熒光定量PCR檢測(cè)Pcipg5在辣椒疫霉菌接種后病株內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平；通過(guò)Western雜交檢測(cè)靶基因在辣椒疫病株內(nèi)翻譯表達(dá)水平；通過(guò)酵母真核表達(dá)體系表達(dá)靶基因，Ni-

5、親和層析純化蛋白，蛋白活性檢測(cè)；純化后蛋白接種辣椒葉片，檢測(cè)靶基因?qū)苯啡~片的破壞和細(xì)胞壁降解作用。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)Pcipg5在辣椒疫霉菌侵染寄主時(shí)是一個(gè)具有致病活性的基因。
　　 利用游動(dòng)孢子懸浮液接種辣椒葉片，熒光PCR檢測(cè)辣椒疫霉菌中9個(gè)多聚半乳糖醛酸酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；將9個(gè)基因與糖基化全突變基因PVX瞬時(shí)表達(dá)，接種辣椒幼苗。熒光PCR檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)，Pcipg5、Pcipg2、Pcipg21在辣椒疫霉菌侵染寄主早期表達(dá)；Pc

6、ipg16、Pcipg18、Pcipg13、Pcipg15、Pcipg20在侵染中期表達(dá)；Pcipg11在侵染后期表達(dá)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PVX瞬時(shí)表達(dá)分析突變后的基因接種后PVX/Pcipg15-N68癥狀比PVX/Pcipg15嚴(yán)重、PVX/Pcipg2-NQ癥狀比PVX/Pcipg2嚴(yán)重，其他的糖基化位點(diǎn)全突變的基因PVX瞬時(shí)表達(dá)癥狀比未糖基化位點(diǎn)突變基因癥狀弱，表明糖基化位點(diǎn)在辣椒疫霉菌侵染辣椒寄主時(shí)多聚半乳糖醛酸酶降解果膠的過(guò)程中起

7、一定的作用。
　　 通過(guò)多聚半乳糖醛酸酶Pcipg5、Pcipg2、Pcipg21基因和糖基化位點(diǎn)突變基因PVX瞬時(shí)表達(dá)、酵母真核表達(dá)純化后pH穩(wěn)定性活性分析、熱穩(wěn)定性活性分析、蛋白辣椒寄主接種等試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Pcipg5基因的N252糖基化位點(diǎn)在PCIPG5蛋白活性上起正調(diào)控作用；單個(gè)糖基化位點(diǎn)N34，N76，N137在PCIPG2蛋白活性中起正調(diào)控，三個(gè)糖基化位點(diǎn)相互作用起負(fù)調(diào)控作用；糖基化位點(diǎn)N186、N322在Pcipg21

8、表達(dá)的蛋白中起正調(diào)控作用；糖基化位點(diǎn)N374在PCIPG21蛋白中起負(fù)調(diào)控作用。糖基化全突變后蛋白活性降低，可能是所有的糖基化在辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶Pcipg21基因表達(dá)蛋白中起正調(diào)控作用。研究表明不同的糖基化對(duì)蛋白的活性和致病作用各有不同。
　　 本研究從基因和蛋白水平上分析了Pcipg5的功能和辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶糖基化對(duì)于酶的影響。通過(guò)PVX瞬時(shí)表達(dá)研究糖基化的多少，有無(wú)與多聚半乳糖醛酸酶致病性的關(guān)系，每個(gè)基因