糖基化設(shè)計(jì)對(duì)β-葡萄糖醛酸苷酶結(jié)構(gòu)和性能的影響.pdf

1、蛋白質(zhì)的糖基化對(duì)其正確折疊、生物活性、溶解度、抗原性和穩(wěn)定性等功能起到重要作用，但由于糖基化對(duì)蛋白功能調(diào)節(jié)的機(jī)理尚不清楚，使有目的地通過(guò)糖基化對(duì)酶蛋白進(jìn)行改性受到限制。因此，本文以畢赤酵母為表達(dá)宿主，以β-葡萄糖醛酸苷酶為研究對(duì)象，利用半理性設(shè)計(jì)及分子動(dòng)力學(xué)模擬方法，并結(jié)合糖蛋白光譜學(xué)和熱力學(xué)特性研究糖鏈與蛋白的結(jié)合構(gòu)象及構(gòu)象與功能之間的關(guān)系，為利用糖基化對(duì)酶蛋白進(jìn)行定向改性提供理論基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下:
　　分析并鑒定了β-葡

2、萄糖醛酸苷酶的潛在糖基化位點(diǎn)，確定了四個(gè)位于不同結(jié)構(gòu)域的潛在糖基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)N28位糖基化能顯著提高酶的活性，N383位能顯著提高酶的熱穩(wěn)定性，N231位對(duì)酶活及蛋白穩(wěn)定性無(wú)顯著影響，而N594位的糖鏈對(duì)其它三個(gè)位點(diǎn)的糖鏈與蛋白之間的穩(wěn)定構(gòu)象起到平衡作用。
　　采用半理性設(shè)計(jì)獲得了位于該酶12個(gè)Loop/Turn的22個(gè)新糖基化位點(diǎn)，其中N26、N150和N543位點(diǎn)糖基化修飾后可大幅度提高酶活，同時(shí)N26和N150位點(diǎn)的修飾還提

3、高了酶的催化效率，而N115和N418位點(diǎn)的修飾提高了酶對(duì)底物的親和性。研究還發(fā)現(xiàn)不同位點(diǎn)的糖基化對(duì)酶的最適pH和最適溫度范圍無(wú)顯著影響，但N40位點(diǎn)的糖基化修飾使酶在70℃半衰期提高到了147.5min，提高了近十倍，而N418位點(diǎn)修飾卻顯著降低了酶的熱穩(wěn)定性。
　　研究了糖基化調(diào)節(jié)酶熱穩(wěn)定性的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)糖基化修飾后熱穩(wěn)定性好的糖基化突變酶N40中點(diǎn)轉(zhuǎn)換溫度Tm3最高，為75.07℃，變性焓變(ΔH)較小，且比其它突變酶多一次構(gòu)

4、象轉(zhuǎn)換，而熱穩(wěn)定最差的糖基化突變酶N418的Tm3比其它酶降低了至少5℃，且ΔH較大。熒光光譜和圓二色光譜分析表明糖鏈的修飾使蛋白熒光發(fā)射基團(tuán)微環(huán)境的極性增加，改變了酶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，70℃孵育后只有N40仍保留較好的二級(jí)結(jié)構(gòu)，且酶去折疊中間態(tài)的自由能變提高了16kcal·mol-1，顯著增加了酶的構(gòu)象穩(wěn)定性。
　　分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示N40位點(diǎn)的糖鏈在兩個(gè)亞基間形成了“糖基發(fā)卡”的結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)能最小;N208位的糖鏈則在三個(gè)結(jié)構(gòu)域