葡萄糖和O-GlcNAc糖基化對(duì)hBMSCs的影響.pdf

1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)因其較強(qiáng)的增殖能力和潛在的分化多能性在組織工程再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展前景。然而當(dāng)前體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，部分hBMSCs會(huì)出現(xiàn)增殖緩慢、過早凋亡、衰老甚至分化抑制等問題，嚴(yán)重影響其作為種子細(xì)胞的運(yùn)用，而hBMSCs外培養(yǎng)的微環(huán)境則在其中扮演著重要的角色。
　　葡萄糖作為生命的核心能量來源和重要代謝產(chǎn)物，體內(nèi)外微環(huán)境中葡萄糖顯著影響著細(xì)胞的增殖、凋亡、衰老和分化。氨基己糖合成通路(HBP)是細(xì)胞營養(yǎng)狀

2、態(tài)的感應(yīng)器，微環(huán)境中葡萄糖濃度變化可以通過HBP影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化水平。O-GlcNAc糖基化作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，眾多細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)都可以被其修飾，在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。O-GlcNAc糖基化影響細(xì)胞增殖、凋亡、衰老、分化、代謝調(diào)節(jié)、壓力反應(yīng)等，其異常與人類多種疾病有關(guān)。另外，磷酸化和O-GlcNAc糖基化在細(xì)胞生命活動(dòng)中有著復(fù)雜聯(lián)系:它們可以在蛋白質(zhì)發(fā)生同、異位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)抑制和

3、協(xié)同作用等現(xiàn)象。細(xì)胞周期蛋白(Cyclin D1)是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子，caspase-3是直接作用于細(xì)胞引發(fā)凋亡的關(guān)鍵終端因子。O-GlcNAc糖基化抑制PKCα的活性。高糖環(huán)境TGF-β誘導(dǎo)的hBMSCs成軟骨分化中活性降低、TGF-β RⅡ表達(dá)量下調(diào)。因此探究葡萄糖對(duì)hBMSCs的影響，及O-GlcNAc糖基化在其中發(fā)揮哪些作用有著重要價(jià)值。
　　本課題研究中，我們首先觀察體外培養(yǎng)微環(huán)境中高糖環(huán)境和細(xì)胞蛋白質(zhì)高O-GlcN

4、Ac糖基化對(duì)hBMSCs增殖、衰老、凋亡和成軟骨分化的影響，再對(duì)其中的部分機(jī)制進(jìn)行了探索。
　　方法:1.實(shí)驗(yàn)分組:
　　常糖組（葡萄糖5.5mmol/L），高糖培養(yǎng)基（葡萄糖25mmol/L），常糖O-GlcNAc糖基化組（葡萄糖5.5mmol/L，Thiamet-G1.0mol/L），高糖O-GlcNAc糖基化組（葡萄糖25mmol/L，Thiamet-G1.0mol/L）。Thiamet-G為O-GlcNAc糖基化水解

5、酶抑制劑。
　　成軟骨分化常規(guī)誘導(dǎo)組、成軟骨分化O-GlcNAc糖基化誘導(dǎo)組（Thiamet-G）、成軟骨分化PKC抑制劑誘導(dǎo)組(G(o)6983)。G(o)6983為PKC活性抑制劑。
　　2.葡萄糖對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化的影響。
　　hBMSCs于常糖和高糖環(huán)境培養(yǎng)5天后，Western blot檢測(cè)hBMSCs內(nèi)總體蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化水平
　　3.葡萄糖與O-GlcNAc糖基化對(duì)hB

6、MSCs增殖的影響。
　　hBMSCs培養(yǎng)1、3、5、7天后，WST-1法檢測(cè)hBMSCs增殖。
　　4.葡萄糖與O-GlcNAc糖基化對(duì)hBMSCs周期作用。
　　hBMSCs培養(yǎng)5天后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Cyclin D1表達(dá)水平。
　　5.葡萄糖與O-GlcNAc糖基化對(duì)hBMSCs凋亡作用。
　　hBMSCs培養(yǎng)5天后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)hBMSCs凋亡，RT-PCR檢查cas

7、pase-3表達(dá)水平。
　　6.葡萄糖與O-GlcNAc糖基化對(duì)hBMSCs衰老作用。
　　hBMSCs培養(yǎng)5天后，β-半乳糖糖苷染色法檢測(cè)hBMSCs衰老。
　　7.葡萄糖與O-GlcNAc糖基化對(duì)hBMSCs向軟骨分化作用。
　　實(shí)時(shí)定量PCR檢查成軟骨分化的標(biāo)志:Sox9、ColⅡ、AGN基因的表達(dá);Westernblot檢測(cè)PKC、p-PKC、TGF-β RⅡ蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:1.高糖組相較于低

8、糖組hBMSCs蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高。
　　2.高糖組、低糖O-GlcNAc糖基化組和高糖O-GlcNAc糖基化組相較于低糖組抑制hBMSCs增殖。
　　3.高糖組、低糖O-GlcNAc糖基化組和高糖O-GlcNAc糖基化組相較于低糖組阻滯hBMSCs G1/S期轉(zhuǎn)換、下調(diào)Cyclin D1 mRNA表達(dá)。
　　4.高糖組、低糖O-GlcNAc糖基化組和高糖O-GlcNAc糖基化組相較于低糖組促進(jìn)hBM

9、Ss凋亡，上調(diào)caspase-3 mRNA表達(dá)。
　　5.高糖組、低糖O-GlcNAc糖基化組相較于低糖組下調(diào)hBMSs成軟骨分化標(biāo)志Sox9、ColⅡ、AGN mRNA表達(dá)，阿爾新藍(lán)染色變淺軟骨組織中酸性粘多糖含量減少。
　　6.成軟骨分化O-GlcNAc糖基化誘導(dǎo)組、成軟骨分化PKC抑制劑誘導(dǎo)組相較于成軟骨分化常規(guī)誘導(dǎo)組，PKC表達(dá)量相同但磷酸化PKC表達(dá)量顯著降低， TGF-β RⅡ表達(dá)顯著下調(diào)。
　　結(jié)論:1.

10、本研究證實(shí)微環(huán)境中高糖會(huì)促進(jìn)hBMSCs細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平升高。鑒于O-GlcNAc糖基化在細(xì)胞生命活動(dòng)的廣泛作用，該結(jié)果產(chǎn)生的一系列生物學(xué)效應(yīng)值得我們深入探究.
　　2.本研究證實(shí)高糖微環(huán)境抑制hBMSCs細(xì)胞增殖、阻滯其G1/S期轉(zhuǎn)換、促進(jìn)其凋亡和衰老。
　　3.本研究證實(shí)蛋白質(zhì)高O-GlcNAc糖基化抑制hBMSCs細(xì)胞增殖、阻滯其G1/S期轉(zhuǎn)換、促進(jìn)其凋亡和衰老。
　　4.本研究證實(shí)高糖環(huán)境