利用糖基化轉(zhuǎn)移酶對染料木素糖基化的研究.pdf

1、大豆異黃酮具有良好的類雌激素作用，同時也是一種天然的癌癥預(yù)防劑。染料木甙是大豆異黃酮中的一種，與其他種類的大豆異黃酮相比，染料木甙的雌激素活性相對最高，其預(yù)防婦女更年期綜合癥以及抗癌作用的效果也最好。但是市售的大豆異黃酮成分較雜，導(dǎo)致其功能效果不明顯。
　　 本研究運(yùn)用生物轉(zhuǎn)化法，利用糖基化轉(zhuǎn)移酶將染料木素一步轉(zhuǎn)化為染料木甙。從豆芽和蠟狀芽孢桿菌ATCC10987的基因組中分別克隆糖基化轉(zhuǎn)移酶GmlF7GT和BcGT-1的基因，

2、選用枯草芽孢桿菌載體pHT43和大腸桿菌載體pETDuet-1和pMAL-c2X，分別構(gòu)建基因工程菌，在兩種表達(dá)系統(tǒng)中分別進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)的研究。主要工作如下:
　　 1、成功構(gòu)建枯草芽孢桿菌pHT43-GmlF7GT/WB600和pHT43-BcGT-1/WB600并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE驗證，兩株基因工程菌均無目的蛋白大小的條帶。取粗酶液進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)HPLC和LC-MS分析，反應(yīng)體系中均無目的產(chǎn)物的產(chǎn)生。分析原因為選

3、用的宿主菌WB600自身分泌的蛋白酶將兩種糖基化轉(zhuǎn)移酶GmlF7GT和BcGT-1降解，故構(gòu)建的基因工程菌表達(dá)的外源蛋白不能進(jìn)行催化。
　　 2、成功構(gòu)建大腸桿菌 pETDuet-1-BcGT-1/BL21、pMAL-c2X-BcGT-1/BL21 pETDuet-1-GmlF7GT/BL21和pMAL-c2X-GmIF7GT/BL21并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過驗證，四株基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)的外源蛋白均具有催化活性，經(jīng)與底物染料木素反應(yīng)