畢赤酵母表達系統(tǒng)糖基化修飾改造研究.pdf

1、隨著蛋白質(zhì)藥物需求量的遞增，酵母表達系統(tǒng)逐漸引起人們的關(guān)注?；蚬こ痰目焖侔l(fā)展，使酵母的人源化改造成為可能。本實驗室前期已經(jīng)通過二次同源重組技術(shù)成功敲除畢赤酵母的α-1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(OCH1p)基因，阻斷了酵母的高甘露糖基化途徑，得到了過度糖基化缺陷株GJK0Ⅰ(OCH(I)-)，然后把釀酒酵母α-1，2-甘露糖苷酶(MnsⅠ)基因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號與來自擬南芥的α-1，2-甘露糖苷酶Ⅰ(α-1，2-mannosidaseⅠ，MDSⅠ

2、)基因融合，定點整合到畢赤酵母基因組上，獲得了能夠合成哺乳動物MansGlcNAc2復(fù)雜型甘露糖型的人源化糖基工程酵母，部分實現(xiàn)了酵母的人源化改造，已用于蛋白質(zhì)藥物的表達。但是酵母表達系統(tǒng)仍然存在一些缺陷，影響了它的推廣，這其中就包括糖基工程酵母N-糖基化不完全和過度O-糖基化的問題，我們對此開展了研究。
　　對于酵母N-糖基化修飾不完全的問題，我們采用導(dǎo)入外源N-糖基轉(zhuǎn)移酶的方式予以改善。利用尿嘧啶(URA3)營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記

3、，在酵母菌株4-32中轉(zhuǎn)入醇氧化酶啟動子(alcohol oxidase promoter，AOX1)控制的利士曼原蟲N-糖基轉(zhuǎn)移酶(stauroporine and temperature sensitivity3，STT3)D亞基，構(gòu)建一株過表達N-糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基工程酵母菌株4-32-STT3D。通過SDS-PAGE，Western Blot和N-糖肽酶(peptide-N-asparigine amidase F，PNGase

4、F)酶切等方法，分析其表達的抗HER2抗體(anti-human epidermal growth factor receptor2)的N-糖基化程度。SDS-PAGE結(jié)果顯示，4-32-HL酵母菌表達的抗HER2抗體除與哺乳動物細(xì)胞表達的商業(yè)化的抗體有相同的55×103左右的重鏈主帶外，還有一條相對分子質(zhì)量約為50×103的條帶。PNGase F酶切后，上述重鏈均呈50×103的均一條帶，WesternBlot分析證明這些條帶均為抗體

5、成分。則50×103的均一條帶條帶即為未糖基化的抗體重鏈。而轉(zhuǎn)入STT3D的工程菌4-32-HL-STT3D菌表達的抗HER2抗體則為均一的55×103條帶，無未糖基化的50×103條帶。用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)作為報告蛋白驗證STT3D的作用，SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)普通糖基工程酵母菌4-32-GMCSF表達的GM-CS

6、F呈現(xiàn)為22×103和20×103的兩條帶，而轉(zhuǎn)入STT3D后的4-32-GM-CSF-STT3D工程菌表達的則為均一的22×103條帶。PNGase F酶切后，這些條帶均為相對分子質(zhì)量約18×103的均一條帶。由于GM-CSF有Asn27，Asn37兩個N-糖基化位點，所以推測22×103是兩個位點均發(fā)生了糖基化形成的條帶，20×103是僅一個位點發(fā)生糖基化形成的條帶。
　　考慮到STT3D表達載體由AOX1甲醇誘導(dǎo)型啟動子控制

7、啟動，所以我們分別研究了STT3D基因非誘導(dǎo)和STT3D誘導(dǎo)時對酵母生長的影響。統(tǒng)計學(xué)分析顯示STT3D非誘導(dǎo)時，轉(zhuǎn)入STT3D的4-32-HL-STT3D菌(+STT3D)與未轉(zhuǎn)入STT3D的陰性對照菌4-32-HL(-STT3D)生長情況相比，p=0.032＞0.01，說明兩者無顯著區(qū)別，提示STT3D非誘導(dǎo)時對酵母生長沒有影響;STT3D誘導(dǎo)時，p＜0.0001，兩者差異性顯著，提示STT3D誘導(dǎo)表達對酵母生長影響十分明顯。

8、>　　另一方面對于酵母過度O-糖基化修飾的問題，常規(guī)手段是采用敲除的方式阻斷基因表達，但是考慮到酵母O-糖基轉(zhuǎn)移酶PMTs對酵母生長是不可或缺的，敲除致死，擬采用可誘導(dǎo)的阻遏方式抑制該過程。根據(jù)參考文獻報道的CRISPR-Cas9具有的靶向敲除功能，將Cas9突變?yōu)閐cas9，并由dcas9設(shè)計成由誘導(dǎo)型啟動子D6控制誘導(dǎo)表達，這樣dcas9既保留了與靶位點特異性結(jié)合的能力，又失去了核酸內(nèi)切酶活性，還具有誘導(dǎo)控制PMTs基因啟動的特點。

9、為了讓dcas9阻遏蛋白進入細(xì)胞核發(fā)揮作用，我們采用了在dcas9基因的3'端融合核定位信號(nuclear localization sequence，NLS)編碼區(qū)和在dcas9基因的5'端和3'端均融合NLS編碼區(qū)兩種策略。pmt-gRNA基因由pmt1-gRNA、pmt2-gRNA和pmt4-gRNA基因串聯(lián)形成，其轉(zhuǎn)錄出的pmt1-gRNA、pmt2-gRNA和pmt4-gRNA mRNA分別錨定到pmt1、pmt2和pmt4

10、的轉(zhuǎn)錄起始位點上游，由此構(gòu)建了pGE-D6-dcas9-pmt-gRNA和pGE-D6-NLS-dcas9-pmt-gRNA兩種靶向阻遏載體，利用尿嘧啶(URA3)營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)入酵母JC307(ura3-，his)菌。再將僅有O-糖基化位點而不具有N-糖基化位點的粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）導(dǎo)入JC307(ura3-，his-)作為報告蛋白，誘導(dǎo)表達

11、后質(zhì)譜分析兩種靶向阻遏載體表達的阻遏蛋白對G-CSF的O-糖基化抑制效果。MALDI-TOF-MS質(zhì)譜結(jié)果顯示，無dcas9的陰性對照菌表達的G-CSF兩個峰值有9803.2，19612.9兩個峰值，僅C端含NLS的dcas9菌株表達的G-CSF有9801.9，19614兩個峰值，和陰性組峰值接近，表明該方式融合的CRISPR-dcas9靶向阻遏系統(tǒng)無抑制O-糖基化的作用;而dcas9的兩端均有NLS的菌株表達的G-CSF有四個峰值:9