用畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)XA21-LRR及其糖基化的初步研究.pdf

1、水稻是一重要的糧食作物，而白葉枯病是危害水稻生長(zhǎng)的一種嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，水稻遭受白葉枯病后會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)量，因而對(duì)水稻抗白葉枯病基因Xa21的抗病機(jī)理研究將對(duì)于水稻抵御疾病、增加產(chǎn)量以及解決世界人們的溫飽問題具有重要的意義。已知Xa21編碼一個(gè)跨膜的類受體激酶蛋白，推測(cè)它主要有三個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，即LRR區(qū)、跨膜區(qū)和激酶區(qū)，LRR區(qū)是位于膜外的由23個(gè)不完全的富含亮氨酸的重復(fù)序列組成，在水稻抗病反應(yīng)中可能起特異性識(shí)別病原菌無(wú)毒基因產(chǎn)物AVR

2、的作用；已有的研究表明水稻中表達(dá)的XA21是發(fā)生糖基化修飾的(實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)未發(fā)表)，因而推測(cè)XA21蛋白質(zhì)上的膜外LRR區(qū)發(fā)生了糖基化修飾，并且LRR上糖鏈的存在可能充當(dāng)了抗病反應(yīng)過程中的信號(hào)天線的角色，用來(lái)識(shí)別病原菌的入侵。本研究利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)XA21蛋白質(zhì)的膜外LRR區(qū)，即利用畢赤酵母分泌型表達(dá)載體構(gòu)建含有目的基因的重組載體，將重組載體轉(zhuǎn)化到畢赤酵母細(xì)胞中，通過營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選和G418抗性篩選后，再通過PCR驗(yàn)證重組載體整合

3、到酵母基因組中的情況，將PCR驗(yàn)證過的陽(yáng)性重組子用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24h取一次上清，直至120h，-80℃凍存，最后通過SDS-PAGE及WesternBlot檢測(cè)上清中目的蛋白的表達(dá)情況；將表達(dá)的目的蛋白用糖苷酶PNGaseF處理后做SDS-PAGE或WesternBlot分析，通過檢測(cè)經(jīng)糖苷酶處理后目的蛋白分子量的減少來(lái)說明目的蛋白發(fā)生了糖基化修飾，后續(xù)的工作可以通過質(zhì)譜分析確定糖基化位點(diǎn)；本研究首先利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的分泌